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Journal of Tropical Oceanography >

2025 , Vol. 44 >Issue 2: 84 - 91

DOI: https://doi.org/10.11978/2024108

Marine Biology

Morphological classification and phagocytosis of haemocytes in Spondylus sp.

  • ZHOU Kexin ,
  • ZHEN Wenjing ,
  • ZHANG Wenwen ,
  • WANG Jiangyong
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  • Huizhou University, Huizhou 516000, China
WANG Jiangyong. email:

Copy editor: YIN Bo

Received date: 2024-05-25

  Revised date: 2024-07-22

  Online published: 2024-08-14

Supported by

Guangdong Provincial Department of Education Marine Shellfish Ecological Aquaculture and Disease Prevention and Control Innovation Team Project(2021KCXTD057)

Professors and doctors of Huizhou University started the project(15604220001)

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Abstract

Blood cells, as the main immune effector cells, play a very important role in the immune defense system of shellfish. The morphology, type and phagocytosis function of hemocytes of Spondylus sp. were studied by means of blood cell count, Giemsa staining, transmission electron microscopy, scanning electron microscopy and fluorescence phagocytosis. The results showed that the blood cell density of the Spondylus sp. was 3.296 × 106 cells·mL-1, and the blood cells differ significantly in size and with regard to whether they contain particles within the cytoplasm. Based on these differences, they are subdivided them into four types: hyalinocyte (9.74%), granulocyte (58.14%), agranular haemocyte (27.50%) and lymphoid (4.62%). Hyalinocytes, agranular haemocytes, granulocytes and lymphoids could be observed under transmission electron microscope. Under the observation of scanning electron microscope, four different types of cells can be clearly distinguished, which are oval cells, round cells, spindle cells, nucleated (conical) cells. A phagocytosis experiment was carried out with Escherichia coli BL21 labeled with the green fluorescent protein (GFP), and the results showed that the phagocytosis of the blood cells from Spondylus sp. was mainly dependent on granulocytes.

Key words： Spondylus sp.; haemocyte; morphological classification; granulocyte; agranulocyte; phagocytosis

Cite this article

ZHOU Kexin , ZHEN Wenjing , ZHANG Wenwen , WANG Jiangyong . Morphological classification and phagocytosis of haemocytes in Spondylus sp.[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2025 , 44(2) : 84 -91 . DOI: 10.11978/2024108

在自然环境中, 贝类所居之处充斥着大量的病原微生物。然而, 并非所有这些微生物都能成功感染贝类并引发疾病, 这主要归功于贝类具备的一套全面且有效的非淋巴免疫防御机制。血细胞是贝类细胞免疫的主要承担者, 它可以直接发挥吞噬作用和包囊作用处理异物、参与免疫黏附和伤口修复等过程, 它还可以合成和释放多种水解酶、调理素、凝集素、细胞因子类似物、抗菌肽和其他类型的非特异性免疫因子(谢彦海, 2007)。自1934年起, 贝类血细胞研究逐渐兴起。对贝类动物血细胞的研究主要集中在双壳贝类上, 但时至今日, 贝类血细胞分类还没有一个统一的标准。国内外研究者对贝类血细胞的分类方法和标准不尽相同, 一些研究者根据血细胞的活体形态与行为特征进行分类, 一些根据化学染色剂对血细胞的物理及化学作用不同来分类, 另一些研究者则基于亚显微结构的不同特点对血细胞进行划分, 还有一些研究者利用密度梯度离心法进行分类, 也有一些研究者根据细胞特性利用流式细胞仪进行血细胞的分类(郭磊, 2007)。随着海洋经济贝类养殖规模持续扩大, 伴随而来的是日益严重的病害问题。因此, 深入探讨贝类动物的免疫防御功能和机制, 特别是其血细胞方面的特性, 已成为当前水产动物病害防控领域研究的重要方向。
海菊蛤(Spondylidae)属于软体动物门(Mollusca), 双壳纲(Bivalvia), 珍珠贝目(Pterioida), 海菊蛤科(Spondylidae), 海菊蛤属(Spondylus)。作为一种暖水性固着型贝类, 主要分布于亚热带海域, 主要生活在浅海和海滩附近的岩石和珊瑚礁上, 当它完成变态后便固着于原地, 终生不会发生移动。海菊蛤的特点是闭壳肌肥大, 可加工成味道鲜美、营养丰富的“干贝”, 这是一种非常难得的美食, 它的外壳也可作为装饰, 因此是当地渔民捕捞的重要贝类之一。海菊蛤目前主要处于野生捕捞阶段, 尚未进行人工养殖。目前, 国内报道了许多贝类如关于牡蛎(宋小瑞, 2016; Mao et al, 2020; Zhang et al, 2020)、栉孔扇贝(孙虎山 等, 2003)、厚壳贻贝(杨丽佳 等, 2011)、杂色鲍(王江勇 等, 2010)等贝类血细胞类型及免疫防御功能的研究, 但尚未有海菊蛤血细胞的形态结构类型和免疫功能相关的研究报道。
本文采用染色、透射电子显微镜、扫描电子显微镜、荧光吞噬试验方法对海菊蛤血细胞的形态结构和免疫特性等方面进行研究, 旨在研究海菊蛤血细胞的种类及其所具备的免疫防御机制, 以期在贝类血细胞分类方面提供科学依据, 从而为海菊蛤的人工规模化养殖和病害防治提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验用海菊蛤

海菊蛤取自广东省深圳市某海鲜批发市场, 规格为5~10cm, 外观健康正常。买回的海菊蛤暂养于玻璃缸中, 不间断充气, 定时换水, 不投喂, 试验于2023年12月—2024年4月间进行。

1.2 血细胞悬液制取

取健康的海菊蛤个体, 分别从闭壳肌中用1mL的注射器抽取血淋巴, 置于1.5mL离心管中, 在4℃的条件下, 以1000r·min-1的转速进行离心处理2min, 去除上清液, 沉淀即为血细胞, 加入1 × PBS细胞培养液, 制成血细胞悬液, 放于冰上备用。

1.3 血细胞计数

取新鲜的海菊蛤血细胞悬液50μL, 将其滴在XB-K-25型血球计数板上, 每个计数室均具备恒定的体积, 具体数值为0.1mm3, 光镜10 × 40倍下计数3次, 取平均值。血细胞数(单位: cells·mL-1)可以通过以下公式求得: 血细胞数量 = 测得血细胞数 × 稀释倍数 × 50000。

1.4 血细胞光镜观察

分别取新鲜的海菊蛤血淋巴悬液50μL滴至清洗干净的载玻片上, 制成血涂片。用70%乙醇200μL固定10min, 然后晾干。接着使用改良吉姆萨染色液(20×)和去离子水以1∶19的比例充分混匀制得改良吉姆萨染色工作液(1 ×)备用。固定完成后, 滴加400μL配制好的改良吉姆萨染色工作液(1 ×)染色45min, 对血涂片一侧用蒸馏水充分清洗, 室温下晾干。DM500显微镜下进行观察并拍照, 并在光镜10 × 100倍下随机取30个视野, 鉴定和计数血细胞类型, 计算各类血细胞比例。

1.5 血细胞透射电镜观察

取外壳完整的海菊蛤健康个体, 用1mL注射器从闭壳肌处取血。离心, 去上清, 沉淀用2.5%戊二醛电镜固定液重悬3h。用0.1mol·L-1的磷酸缓冲液(phosphate buffer, PB)(pH 7.4)漂洗, 再用1%锇酸溶液固定2h。固定完成后, 再用0.1mol·L-1 PB (pH 7.4)对样本进行漂洗, 以确保样本中残留的固定剂被彻底去除。乙醇梯度逐级脱水, Epon812包埋, 超薄切片机切片, 经2%醋酸铀饱和乙醇溶液染色和2.6%的枸橼酸铅溶液(避二氧化碳)分别染色8min后, 置于HT7800/ HT7700透射电子显微镜下观察并拍照。

1.6 血细胞扫描电镜观察

取外壳完整的海菊蛤健康个体, 用1mL注射器从闭壳肌处取血。离心, 去上清, 沉淀用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)轻轻漂洗, 弃PBS后加入3%戊二醛固定; 之后, 使用1%锇酸对样本进行后固定, 酒精梯度脱水后, 将样本小心地滴在盖玻片上, 临界点干燥仪干燥。用导电胶将盖玻片粘于样品台上, 离子溅射仪喷金膜, 以提升其导电性能, 置于JSM-IT700HR扫描电镜下观察并拍照。

1.7 血细胞吞噬实验

将标记了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的菌液与LB培养液以1∶1000的比例混合, 摇菌12h, 加入诱导剂IPTG 2μL后再摇6h。8500r·min-1离心5min后, 加入100μL PBS重悬, 重复操作3次。抽取海菊蛤的血液, 各取2mL血液分别放于24孔细胞培养板中, 培养箱37℃孵育30min, 加入菌液30μL, 吞噬30min, 去菌液, 用PBS洗一次。4%多聚甲醛固定液固定20min, PBS再洗一次, 置于荧光显微镜下观察并拍照(Fabrello et al, 2022)。

2 结果与分析

2.1 血细胞计数结果

将50μL的海菊蛤血细胞悬液滴在XB-K-25型血球计数板上, 光镜10 × 40倍下计数3次, 取平均值, 结果表明, 海菊蛤的血细胞浓度为3.296 ×106cells·mL-1。

2.2 血细胞光镜观察结果

根据光镜下血涂片Giemsa染色观察结果显示, 海菊蛤的血细胞主要分为以下4种类型:
透明细胞(hyalinocyte, HC)(图1b、1e、1f): 活体细胞呈扇形或椭圆形, 细胞表面光滑, 细胞质中内含物稀少为透明状, 胞体宽大且伸展能力较强, 细胞核较小, 侧位或中位分布, 该种细胞的核质比较低, Giemsa染色细胞核呈现蓝紫色, 细胞质为淡蓝色, 约占细胞总数的9.74% (图2)。
图1 海菊蛤血细胞光学显微镜观察(1000 ×)

G: 颗粒细胞; AG: 无颗粒细胞; HC: 透明细胞; LY: 淋巴样细胞

Fig. 1 Optical microscope observation of haemocytes in Spondylus sp. (1000 ×). G: granulocyte; AG: agranular haemocyte; HC: hyalinocyte; LY: lymphoid haemocyte

图2 海菊蛤4种类型血细胞的比例

Fig. 2 The proportion of four types of haemocytes in Spondylus sp.

颗粒细胞(granulocyte, G)(图1d, 1e, 1f): 活体细胞形态近似圆形, 其内含丰富的颗粒状物质, 展现出较高的折光性质。此类细胞在贴附于壁面的能力上表现较弱, 且易于破裂。观察发现, 其伪足生成极少或无, 且易于发生脱颗粒现象。在细胞结构特征上, 此种细胞的核质比例相对较高。采用Giemsa染色法处理后, 可见细胞颗粒呈现明显的紫红色, 细胞核则呈现蓝紫色, 此种细胞大约占据了细胞总数的58.14% (图2)。
无颗粒细胞(agranular haemocyte, AG)(图1a、1d、1e、1f): 活体细胞的形态丰富多样, 细胞体积较大, 展现出显著的变形能力。细胞能够延伸出众多的伪足, 这些伪足通常呈现出星状或指状的形态。在细胞质内部, 没有观察到颗粒的存在。细胞核侧位或中位分布, 呈椭圆形或肾形, 异染色质较少, 该种细胞的核质比高, Giemsa染色细胞核呈现蓝紫色, 细胞质为浅蓝色, 约占细胞总数的27.5% (图2)。
淋巴样细胞(lymphoid haemocyte, LY)(图1f): 活体细胞呈圆球形, 细胞的数量偏少, 且个体体积相对较小。此外, 细胞在贴壁和伸展方面的能力较差。在细胞核的形态上, 呈现出圆球形或椭球形的特征, 胞质少, 仅在细胞核边缘有一折光性强的窄边, 该种细胞的核质比较高, Giemsa染色细胞核呈现深蓝色, 细胞质为淡蓝色, 约占细胞总数的4.62% (图2)。

2.3 血细胞透射电镜观察结果

经过透射电子显微镜观察, 发现海菊蛤的血细胞有以下4种主要类型:
颗粒细胞(图3a、3b): 该种细胞呈圆形或椭圆形, 数量众多, 细胞核位置偏位或中位分布, 形状为圆形或肾形。其细胞质内富含密集的电子颗粒, 并可见内质网、溶酶体等细胞器结构清晰。染色质分布均匀, 细胞核与细胞质的比例相对较高。
图3 海菊蛤血细胞透射电子显微镜观察(4000 ×)

a, b. 颗粒细胞; c, d. 透明细胞; e, f. 淋巴样细胞; f. 无颗粒细胞。N: 细胞核; RER: 粗面内质网; LYS: 溶酶体; M: 线粒体; V: 液泡; LY: 淋巴样细胞; AG: 无颗粒细胞

Fig. 3 Morphology of haemocytes in Spondylus sp. by transmission electron microscope (4000 ×). a, b: granulocyte; c, d: hyalinocyte; e, f: lymphoid haemocyte; f: agranulocyte. N: nucleus; RER: rough endoplasmic reticulum; LYS: lysosome; M: mitochondria; V: vacuole; LY: lymphoid haemocyte; AG: agranular haemocyte

透明细胞(图3c、3d): 该种细胞形态多样, 有圆形及不规则形态, 细胞核位置可偏侧或居中, 形态呈椭圆状或肾状, 染色质明显聚集。在细胞质中, 未见显著颗粒, 但具备内质网、线粒体等细胞器结构。此外, 其细胞核与细胞质的比例偏低。
淋巴样细胞(图3e、3f): 该种细胞形态呈圆形或椭圆形, 细胞核位于中央位置, 形态同样为圆形或椭圆形, 细胞核内染色质明显浓缩。细胞质数量少, 沿细胞核边缘分布形成窄边, 内细胞器少, 仅含有少量内质网片段、液泡和线粒体等, 该细胞核质比高。
无颗粒细胞(图3f): 该种细胞形态多样, 细胞核侧位或中位分布, 呈椭圆形或肾形。细胞质内未见颗粒存在, 但胞质内含有丰富的细胞器, 如线粒体、高尔基体、粗面内质网等细胞器。其细胞核与细胞质的比例高。

2.4 血细胞扫描电镜观察结果

根据扫描电镜观察结果, 发现海菊蛤的血细胞有以下4种类型(图4)。
图4 海菊蛤血细胞的形态学-扫描电子显微镜观察

a. 海菊蛤细胞(1500 ×); b. 圆形细胞(10000 ×); c. 椭圆细胞(10000 ×); d. 梭形细胞(10000 ×); e. 梭形细胞(7000 ×); f. 核形(锥形)细胞(8000 ×)

Fig. 4 Morphology of haemocytes in Spondylus sp. by scanning electron microscope. a: spondylidae cells (1500 ×); b: round cells (10000 ×); c: elliptical cells (10000 ×); d: spindle cells (10000 ×); e: spindle cells (7000 ×); f: nucleated (conical) cells (8000 ×)

圆形细胞(图4b): 该种细胞呈现出圆球形的轮廓, 其表面布满了丰富的褶皱和突起, 还延伸出了细长的伪足。根据观察结果判断其为光镜下观察到的透明细胞, 光镜下活体透明细胞呈圆形, 其细胞胞体宽大且伸展能力较强, 有伪足伸出。
椭圆细胞(图4c): 该种细胞呈椭球形, 细胞表面有少许细小的伪足和突起。根据观察结果判断其为光镜下观察到的颗粒细胞, 光镜下颗粒细胞近似圆形, 其伪足生成极少或无。
梭形细胞(图4d、4e): 该种细胞呈梭形, 细胞表面许多褶皱和少量伪足。根据观察结果判断其为淋巴样细胞, 光镜下淋巴样细胞个体体积相对较小, 其贴壁和伸展方面的能力较差, 胞质少, 伪足生成极少。
核形(锥形)细胞(图4f): 该种细胞呈锥形, 细胞表面有许多突起和褶皱, 小部分突起和褶皱较少, 有伪足伸出。根据观察结果判断其为无颗粒细胞, 光镜下无颗粒细胞形态丰富多样, 细胞体积较大, 有较强的变形能力, 细胞延伸出众多呈星状或指状的伪足。

2.5 血细胞吞噬实验

荧光显微镜下, 标记GFP荧光蛋白的大肠杆菌BL21发出绿色荧光, 当明场下的海菊蛤细胞内出现了散发绿色荧光的大肠杆菌时, 就认为是海菊蛤的血细胞发生了吞噬作用。根据荧光显微镜电观察结果(图5)显示, 海菊蛤的血细胞吞噬作用主要通过颗粒细胞和无颗粒细胞得以实现, 透明细胞与淋巴样细胞并未参与此过程。此外, 有少量无颗粒细胞在体外环境下能迅速形成伪足, 形态呈长纤维状, 它未呈现吞噬功能, 可能是用于血细胞凝集。
图5 海菊蛤血细胞的吞噬实验-荧光显微镜观察

a, d. 明场/海菊蛤血细胞(400 ×); b, e. GFP/大肠杆菌BL21 (400 ×); c, f. Merge (400 ×)。G: 颗粒细胞; HC: 透明细胞

Fig. 5 Phagocytosis experiment and fluorescence microscope observation of haemocytes in Spondylus sp.. a, d: Bright field/Spondylus sp. haemocyte (400 ×); b, e: GFP/Escherichia coli BL21 (400 ×); c, f: Merge (400 ×). G: granulocyte; HC: hyalinocyte

3 讨论

本文通过血细胞计数、Giemsa染色、透射电镜、扫描电镜研究了海菊蛤血细胞的形态与类型; 利用荧光吞噬的方法研究了海菊蛤血细胞的吞噬功能。

3.1 海菊蛤血细胞的类型

试验结果表明, 海菊蛤血细胞的密度为3.296 ×106cells·mL-1, 这与国内外已经报道的大多数贝类的血细胞处于同一数量级, 如贻贝为5.68 × 106cells·mL-1(Wootton et al, 2003)、池蝶蚌为(1.08~2.08) × 106cells·mL-1 (郭磊, 2007)、中华原田螺为2.17 × 106cells·mL-1 (裴鹏祖 等, 2011)。其中颗粒细胞的占比最大, 约占细胞总数的一半, 其次为无颗粒细胞, 接着是透明细胞, 最后是淋巴样细胞, 这说明颗粒细胞是主要的细胞类型。
目前, 关于贝类血细胞形态学的研究报道很多, 但并未形成统一的标准。大部分研究者基于细胞内是否含有明显的颗粒结构, 对贝类血细胞的进行区分, 一致认同将贝类血细胞简单的分为颗粒细胞和无颗粒细胞两大类。顾名思义, 如果细胞质中富含许多折光性强的颗粒, 就定义为颗粒细胞; 如果细胞质中几乎无颗粒或仅有少量颗粒的细胞, 则归为无颗粒细胞。但深入观察发现, 贝类血细胞并非仅限于这两种极端类型, 实际上, 它们之间存在大量的过渡形态。这些过渡类型的血细胞在细胞质中的颗粒含量介于颗粒细胞和无颗粒细胞之间, 所以这种简化的分类方法存在许多不足之处, 因此部分研究者根据血细胞的实际形态对其进行了细分, 从而衍生出多种分类方式。有人根据细胞的形态结构和功能的不同将中华圆田螺的血细胞分为透明细胞、淋巴样细胞、富含颗粒的颗粒细胞和几乎不含颗粒的无颗粒细胞4种类型(裴鹏祖 等, 2011)。也有人根据酸性磷酸酶、过氧化物酶和非特异性酯酶对血细胞的显示定位和Wright染色等多种染色方法, 将三角帆蚌、褶纹冠蚌和圆背角无齿蚌的血细胞分为透明细胞、颗粒细胞、无颗粒细胞和类淋巴细胞4种类型(杨军 等, 2002)。本文根据其形态和功能特征, 经过试验分析, 将海菊蛤血细胞区分为透明细胞、颗粒细胞、无颗粒细胞以及淋巴样细胞4种主要类型。这4种类型的血细胞的密度、形态、大小和比例各不相同。
经过透射电镜的详细观察结果表明, 可以将海菊蛤血细胞划分为颗粒细胞、无颗粒细胞、透明细胞和淋巴样细胞4种类型, 这与褶纹冠蚌的透射电镜下血细胞分类基本一致(谢彦海, 2007)。透射电镜下海菊蛤血细胞的分类与光镜下观察到的细胞互相对应。扫描电镜结果表明, 海菊蛤血细胞可以分为椭圆细胞、圆形细胞、梭形细胞和核形(锥形)细胞4种类型, 这与扇贝的扫描电镜下血细胞的分类基本一致(杨新春, 2006)。扫描电镜下观察到的海菊蛤血细胞与光镜下观察到的细胞互相吻合, 3种观察结果互相对应。

3.2 海菊蛤血细胞的吞噬功能

目前对于贝类的免疫防御机制的报道中, 主要由颗粒细胞来完成吞噬作用, 透明细胞有时也会参与其中, 但不是“主力”。吞噬过程大致可以分为5个阶段: 识别、黏附、摄入、降解、清除。外源异物黏附在颗粒细胞上, 当颗粒细胞接触到异物时, 会迅速启动防御机制, 通过伸展伪足来捕获并包裹这些异物。这些伪足一旦彼此接触, 就会与细胞质膜实现融合, 进而共同构建成吞噬体, 并将其带入细胞内部。随后, 吞噬体会与溶酶体发生融合, 溶酶体内部富含的水解酶能有效降解并消化吞噬体所携带的异物。值得一提的是, 颗粒细胞还能借助吞噬作用激发的呼吸爆发, 生成丰富的活性氧自由基, 从而有效地杀伤并吞噬外源微生物。吞噬作用不仅在清除如细菌、真菌、生物大分子以及自身坏死细胞等外源异物方面起着重要的作用, 还可以为细胞提供营养物质(郭磊, 2007)。包囊作用又称为受挫的吞噬作用, 当外源异物体积超出单个血细胞的吞噬能力时, 比如寄生虫、外源植入物以及坏死组织等较大的异物, 由于体积较大, 单个血细胞往往难以直接将其完全吞噬, 在此情况下, 多个吞噬细胞会协同行动, 共同围绕外源异物进行包裹。这些血细胞在异物表面充分伸展, 形成一层紧密的细胞层, 实现对异物的全面覆盖。随后, 通过细胞内消化与细胞外消化机制的协同作用, 共同清除被包裹的外源异物。荧光吞噬试验结果表明, 海菊蛤血细胞的吞噬作用主要依赖于颗粒细胞, 透明细胞与淋巴样细胞并未参与此过程。许多研究者认同贝类血细胞中颗粒细胞的吞噬作用, 如在栉孔扇贝(邢婧, 2002)、泥蚶(朱泽闻 等, 2011)等研究中都已经报道了颗粒细胞的吞噬作用。颗粒细胞具有吞噬侵入的外源异物的能力。这是由于颗粒细胞内的颗粒主要为溶酶体, 内含多种水解酶, 能消化其所摄取的病原体或其他异物。

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