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Journal of Tropical Oceanography >

2025 , Vol. 44 >Issue 3: 141 - 147

DOI: https://doi.org/10.11978/2024175

Marine Biology

Establishment of parentage assignment techniques in Acanthopagrus latus and its applications in stock enhancement assessment

  • LU Youjun , 1 ,
  • CHEN Qiang 1 ,
  • HUANG Liangmin 1 ,
  • YOU Songyuan 1 ,
  • LIU Dingyu 1 ,
  • MA Chao 2 ,
  • WU Shuiqing 2 ,
  • LIU Xiande , 1
Expand
  • 1. Fujian Provincial Key Laboratory of Marine Fishery Resources and Eco-environment, Fisheries College of Jimei University, Xiamen 361021, China
  • 2. Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361013, China
LIU Xiande. email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2024-09-11

  Revised date: 2024-10-22

  Online published: 2024-10-28

Supported by

Science and Technology Planning Project of Fujian Province, China(2023N0011)

Project of Fujian Institute of Fisheries(S23311)

Open Project of the Fujian Province Key Laboratory of Marine Fisheries Resources and Ecological Environment

Fold

Abstract

To evaluate the stock enhancement effectiveness of Acanthopagrus latus, this study employed highly polymorphic microsatellite markers developed by our research group using the species' genome and established a parentage assignment technology. Based on this, we assessed the stock enhancement effectiveness of A. latus in Xiamen Bay sampled in 2023-2024. The specific findings are as follows: (1) Polymorphic primer screening: from 110 randomly selected microsatellite loci in the A. latus genome, we designed primers and preliminarily screened 9 loci with high polymorphism using a wild A. latus population. (2) Establishment of parentage assignment technology: using known pedigree families of A. latus, including 20 parental fish and 72 offspring, we performed parentage analysis with the 9 selected microsatellite loci. As shown by the results, a total of 145 alleles were detected across the loci, with an average allele number (Na) of 16.11, an average observed heterozygosity (Ho) of 0.788, an average expected heterozygosity (He) of 0.810, and an average polymorphic information content (PIC) of 0.785, indicating high polymorphism. The analysis using the Cervus 3.0.7 software showed that under a 95% confidence level, the parentage assignment success rate was 98.61% when the sex of both parents was known, and 97.22% when the sex was unknown. (3) Stock enhancement evaluation: the parentage assignment technology was applied to 114 released parental fish and 264 recaptured individuals. Among the 264 recaptured A. latus, 8 were identified as offspring of the released parents, indicating a resource contribution rate of 3.03% to the wild A. latus population. The results provide reliable technical methods for future genetic resource identification and stock enhancement evaluation of A. latus.

Key words： Acanthopagrus latus; microsatellite; parentage assignment; stock enhancement

Cite this article

LU Youjun , CHEN Qiang , HUANG Liangmin , YOU Songyuan , LIU Dingyu , MA Chao , WU Shuiqing , LIU Xiande . Establishment of parentage assignment techniques in Acanthopagrus latus and its applications in stock enhancement assessment[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2025 , 44(3) : 141 -147 . DOI: 10.11978/2024175

微卫星又称为短串联重复序列(short tandem repeat, STR)或简单重复序列(simple sequence repeats, SSR), 由1~6个核苷酸的串联重复片段(motif)构成, 广泛且均匀地分布于真核生物基因组中, 遵循孟德尔遗传定律, 呈共显性遗传(余成晨 等, 2021)。微卫星标记含有丰富的遗传信息, 操作简便, 可自动化检测, 现已成功应用于水产动物的群体遗传分析(张敏莹 等, 2022; 王亚军, 2023; 王九龙 等, 2024)、种质鉴定(Yu et al, 2015)、亲子鉴定(Jerry et al, 2006; Castro et al, 2007; 赵广泰 等, 2010)及分子标记辅助育种(郑卫卫 等, 2016)等领域。随着新一代测序技术的应用, 通过全基因组数据挖掘微卫星标记的方法逐渐普及, 解决了传统微卫星开发方法成本高, 耗时长的弊端。
黄鳍棘鲷(Acanthopagrus latus)隶属于鲈形目(Perciformes)、鲷科(Sparidae)、棘鲷属(Acanthopagrus), 俗称鲛腊鱼、黄脚立、黄翅等, 是一种名贵的海产鱼类, 因其具有经济价值高、食性广、抗逆性强等特点, 已成为我国南方沿海海洋捕捞和网箱养殖重要的渔业物种之一(Pan et al, 2021; Jia et al, 2022)。然而, 在过去的20年里, 由于过度捕捞、环境污染、栖息地破坏等原因, 黄鳍棘鲷自然种群衰退严重, 资源量急剧下降, 亟待对黄鳍棘鲷的自然渔业资源进行恢复和保护。近年来, 福建、广东开展了黄鳍棘鲷的增殖放流工作(江兴龙 等, 2013; 朱克诚 等, 2020), 但具体的效果如何, 缺乏系统的评估。
目前, 标志回捕法是增殖放流效果评估的主要方法, 包括实物标志、生物体标志、分子标志三种。实物标志多采用剪鳍、挂牌、注色等方法, 该方法易操作, 但会损伤幼苗和易脱落(程家骅 等, 2010); 生物体标志是指用群体结构、寄生生物等生物学特征来区分的标志方法, 费时费力, 只应用于较少的水产生物(Wang et al, 2006); 分子标志是指以遗传物质中核苷酸序列的差异为基础的遗传标记, 主要包括微卫星标记和SNP标记, 微卫星标记具有共显性、多态性高、分辨力好等特点, 相比于实物标志, 微卫星标记更准确, 对苗种无损伤, 同时微卫星标记在基因组中分布广, 成本较SNP标记更低, 更适合大规模标记, 是评估水产生物增殖放流效果的有效手段(Ren et al, 2022)。
本研究以课题组自己构建的黄鳍棘鲷家系及其对应亲本为材料(系谱关系已知), 建立基于微卫星标记的亲子鉴定技术, 并利用建立的亲子鉴定技术对厦门湾海域黄鳍棘鲷增殖放流效果进行了评估。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验一共有3个阶段: 微卫星多态性引物筛选、亲子鉴定技术建立、增殖放流回捕个体鉴定。每阶段实验所用样本详见表1。
表1 黄鳍棘鲷9个微卫星位点的基本信息

Tab. 1 Basic information of 9 microsatellite loci in A. latus

位点 重复单元 荧光标记 引物序列 片段大小 退火温度/℃
AL1 (GT)10 FAM F: TGTGTCTGTGTGCTCGTGT
R: TGGAGCAACAGAAAACACGC		 141 57℃
AL2 (GTG)7 FAM F: GATCTGGAAATCTGCGGCGA
R: TGGCCCGATCACCACTACTA		 162 58℃
AL3 (CACG)5 FAM F: CTGAATTACACACGTGCACACA
R: AGTGGAAGATGAGCACCGTC		 140 57.5℃
AL4 (GGAC)5 HEX F: GAGGTGATGTGGATGGAGGG
R: GCCCCCCCTCTTCTTTCAAA		 142 58℃
AL5 (TAG)7 FAM F: AAATGTTGGCGTGGTTCACC
R: GCAACAGGACACGAAGAAGC		 150 57℃
AL6 (TGC)7 HEX F: GGTGGGTGGTTAAGTTCAATCC
R: AGAATCTTCCAGCCCATTAAGC		 195 56℃
AL7 (AGG)3 FAM F: GATACTGTCGCAGGCTGAGG
R: AACCACACACACACAAAGCC		 200 58℃
AL8 (ATC)3 HEX F: AGGTAGTACGCAGCACAACC
R: CCTTCCAGAGAGTCTCTTTGAC		 188 57.5℃
AL9 (AGAT)4 HEX F: TACAGTTCTGTGTCGGCTGC
R: GATGCTTGAATTTCCTCCGGG		 186 58℃
第一阶段实验使用的样本是采集于厦门的12尾野生黄鳍棘鲷。
第二阶段实验使用的样本是课题组构建的家系。2020年9月从漳州市漳浦县佛昙镇诚信水产育苗场采购200尾健康无伤的黄鳍棘鲷成鱼, 转运至漳州市龙海区港尾镇东方鲀育种中心暂养, 挑选性腺发育良好的个体作为亲鱼, 采用巢氏设计, 通过人工授精的方式, 构建了19个黄鳍棘鲷全同胞或半同胞家系, 从中选择12个家系及其亲本作为本次实验亲子鉴定的材料, 包括20个亲本(12个母本、8个父本)以及72个子代, 共计92个样本。采集亲鱼鳍条、家系鱼苗, 置于80%酒精中并在4℃保存、备用。
第三阶段实验使用的样本是增殖放流群体的亲本及回捕个体。2022年11月30日, 前往福建漳州市漳浦县志强水产养殖场, 测量收集黄鳍棘鲷放流亲本114尾, 测量表型数据, 剪取黄鳍棘鲷鳍鳍条置于80%酒精中并在4℃保存、备用。2023年3—7月在厦门湾海域开展黄鳍棘鲷放流活动, 共放流480万尾黄鳍棘鲷。2023年8月—2024年6月, 在厦门西海域(海沧石塘和嵩屿)和厦门东部海域(同安后田和澳头)设置5个回捕站点, 利用流刺网和钓具进行逐月的回捕。从每个站点每月回捕的个体中按比例随机挑选了264尾黄鳍棘鲷, 剪取背鳍肌肉置于80%酒精中并在4℃保存、备用(表1)。

1.2 基因组DNA的提取

使用南京诺唯赞DNA提取试剂盒提取黄鳍棘鲷基因组DNA, 用1%的琼脂糖凝胶检测DNA质量, 并使用NanoDrop 2000&8000 分光光度计(Thermo Fisher Scientific)检测DNA的纯度和浓度, 将样品稀释至50ng·μL-1, 放置-20℃保存、备用。

1.3 微卫星位点检索及引物设计

以实验室自有黄鳍棘鲷基因组为参考基因组, 采用检索软件Krait(https://krait.biosv.com)对其全基因组序列中的1~6核苷酸重复类型进行检索和分析。Krait检索的标准设置为单碱基重复大于10次, 二碱基重复大于6次, 三碱基重复以上大于4次。使用Primer 3.0软件(https://primer3.ut.ee)设计引物。初步设计110对微卫星普通引物, 送至厦门擎科生物有限公司合成。

1.4 亲子鉴定技术建立

以12尾厦门海域野生的黄鳍棘鲷DNA为模板, 对上述设计的110对引物进行初次筛选。排除无扩增条带、条带不清晰及多条带引物之后, 共筛选出17对多态性较好的引物。选取其中9对送至生工生物工程(上海生工)有限股份公司合成5′端带有荧光基团(FAM, HEX)的引物。以构建的家系及亲本为材料, 应用9个微卫星进行亲子鉴定分析, 将鉴定结果与真实的系谱关系进行比较, 验证这9个微卫星分子标记亲子鉴定中的准确性。
PCR反应体系(25μL): 12.5μL 2×Taq Master Mix, 1μL上游引物(10μmol·L-1), 1μL下游引物(10μmol·L-1), 2μL DNA模板, 8.5μL ddH₂O。
反应条件为: 95℃预变性3min; 95℃变形15s, 56~60℃退火15s, 72℃延伸60s, 30个循环; 72℃ 5min, 4℃保存。
PCR产物送至生工生物工程(上海生工)有限股份公司进行分析(ABI3730自动测序仪), 使用GeneMapper ID v3.2软件判读基因分型结果。

1.5 增殖放流回捕样本检测

利用建立的亲子鉴定技术对厦门海域增殖放流的114尾放流亲本和264尾回捕个体基因组DNA进行PCR扩增, PCR体系与1.4所述一致。PCR产物送至生工生物工程(上海生工)有限股份公司进行分析。

1.6 数据分析

将获得的基因分型数据导入Cervus 3.0.7(www.fieldgenetics.com)软件进行等位基因频率分析, 模拟分析和亲子关系分析。通过似然率法分析待测子代基因型和亲本基因型的相关性, 确定亲子关系。计算出微卫星位点的等位基因数(number of alleles, Na)、观测杂合度(observed heterozygosity, Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity, He)、多态信息含量(polymorphic information content, PIC)、无效等位基因频率(null allele frequency, FN)。设置模拟参数条件: 模拟子代10000尾, 亲本抽样率100%, 分型错误率1%, 置信度为80%和95%。

2 结果

2.1 多态性位点筛选

以12尾厦门海域野生黄鳍棘鲷DNA样品作为材料, 对设计的110对引物进行初步筛选。筛选扩增效果较好的引物17对, 从中选取9对建立亲子鉴定技术(表1)。

2.2 微卫星位点的信息参数

在92个个体中共检测到145个等位基因, 每个位点的等位基因数(Na)为9~23个, 平均值为16.11个; 杂合观测度(Ho)为0.457~0.989, 平均值为0.788; 期望杂合度(He)为0.589~0.932, 平均值为0.8103个; 多态信息含量(PIC)为0.557~0.906, 平均值为0.785, 均表现出较高的多态性。其中有1个微卫星标记显著偏离了哈迪-温伯格平衡(Hardy Weinberg equal, HWE)(P<0.001)(表2)。
表2 9个微卫星位点在黄鳍棘鲷亲本与子代中的遗传信息

Tab. 2 Genetic information of 9 microsatellite loci in A. latus parents and offspring

位点 Na Ho He PIC HWE FN
AL1 18 0.787 0.821 0.796 NS 0.0204
AL2 9 0.522 0.747 0.700 ** 0.1716
AL3 15 0.815 0.854 0.834 NS 0.0228
AL4 21 0.978 0.906 0.893 ND -0.0427
AL5 17 0.978 0.852 0.832 * -0.0779
AL6 11 0.457 0.589 0.557 NS 0.1333
AL7 23 0.780 0.829 0.808 * 0.0068
AL8 10 0.784 0.764 0.725 NS -0.0197
AL9 21 0.989 0.932 0.922 ND -0.0331
平均值 16.11 0.788 0.8103 0.785 - -

注: NS表示不显著偏离(P>0.05); ND表示无结果; *表示偏离(P<0.05); **表示显著偏离(P<0.01); ***表示极显著偏离(P<0.001)。

2.3 亲子鉴定技术建立

将9个微卫星位点进一步在20尾亲本、72尾子代中进行基因分型, 评估亲子鉴别能力。在双亲性别已知的模型中, 72个体均匹配到一个候选父本与一个候选母本, 亲本匹配率为100%, 经与真实系谱关系比对, 71个体所匹配到的双亲与真实系谱关系完全一致, 有1个体匹配错误, 双亲鉴定成功率为98.61%。在双亲性别未知的模型中, 72个体的亲本匹配率为100%, 经与真实系谱关系比对, 70个体所匹配到的双亲与真实系谱关系完全一致, 有2个体匹配错误, 鉴定成功率为97.22%。综上, 在两种模型下, 亲子鉴定成功率均超过95%(图1)。
图1 不同数量微卫星位点在两种模型下的亲子鉴定成功率

Fig. 1 Parentage assignment success rates under two models with different numbers of microsatellite loci

2.4 回捕个体鉴定

本研究开发了9个微卫星位点用于黄鳍棘鲷的亲子鉴定。在对回捕个体进行鉴定时, 发现7个位点就提供了足够的遗传信息, 出于时间及成本的考虑, 最终使用了其中的7个位点对回捕个体进行鉴定。7个位点在114个亲本及264个回捕样本中共检测出210个等位基因, Na范围在11~43, 平均值为30; Ho范围为 0.463~0.939, 平均值为0.798; He范围为 0.728~0.947, 平均值为0.8698; PIC范围为0.682~0.943, 平均值为0.8559(表3)。AL5、AL6位点极显著偏离了哈迪-温伯格平衡(P<0.001), AL3位点显著偏离哈迪-温伯格平衡(P<0.01), 其他未偏离。
表3 7个微卫星位点在回捕个体中的遗传信息

Tab. 3 Genetic information of 7 microsatellite loci in recaptured individuals

位点 Na Ho He PIC HWE
AL1 29 0.883 0.904 0.895 NS
AL2 11 0.727 0.728 0.682 NS
AL3 24 0.818 0.912 0.904 **
AL4 39 0.864 0.918 0.911 *
AL5 24 0.896 0.882 0.870 ***
AL6 40 0.463 0.797 0.786 ***
AL7 43 0.939 0.947 0.943 ND
平均值 30 0.798 0.8698 0.8559

注: NS表示不显著偏离(P>0.05); ND表示无结果; *表示偏离 (P<0.05); **表示显著偏离 (P<0.01); ***表示极显著偏离(P<0.001)。

利用Cervus 3.0.7软件选择双亲性别未知模型, 对黄鳍棘鲷的亲本与回捕个体进行亲缘关系鉴定。结果显示, 在回捕的264尾黄鳍棘鲷中共鉴定出8尾黄鳍棘鲷为放流亲本的子代个体, 回捕率为3.0303%。其中在厦门东部海域捕获1尾放流亲本子代, 在厦门西部海域捕获7尾放流亲本子代(表4)。
表4 成功鉴定出亲本的回捕个体信息

Tab. 4 Information of recaptured individuals with successfully assigned parents

子代编号 匹配座位数 体长/mm 体重/g 体高/mm 似然率值 候选亲本编号
HB15 7 140 59.6 52 8.31 A33/A42
HB33 6 150 89.29 56 8.58 A51/A102
HB49 6 148 76.87 59 8.41 A56/A64
HB51 7 148 62.31 50 7.69 A11/A28
HB66 7 155 106.35 64 8.41 A71/A86
HB74 6 145 108.37 65 7.71 A43/A46
HB135 6 132 75.74 57 8.44 A1/A48
HB167 6 177 181.74 79 10.7 A7/A38

3 讨论

3.1 黄鳍棘鲷亲子鉴定技术

根据Botstein等(1980)提出的多态性划分标准, PIC>0.5的位点具有高多态性。本研究中9个微卫星位点平均等位基因数为16.11, PIC均值为0.785, 具有高多态性。哈迪-温伯格平衡检验结果显示, 除AL2位点表现为显著偏离哈迪-温伯格平衡外(P<0.01)外, 其他位点均符合哈迪-温伯格平衡(P>0.05)。其中显著偏离的位点, 期望杂合度与观测杂合度相差较大, 可能是因为实验群体出现近交或者存在无效等位基因。AL2位点的无效等位基因频率为0.1716, 大于10%, 也表明无效等位基因是造成其偏离的原因之一。Cervus使用说明也提出少量位点出现哈迪-温伯格不平衡的原因可能是该群体的亲本之间存在近交, 并不会影响似然比计算结果(朱克诚 等, 2020)。
本研究利用9个微卫星标记对72尾黄鳍棘鲷进行亲子鉴定, 两个模型下亲子鉴定成功率均在鉴定率在97%以上。鉴定结果高于大西洋鲑(Salmo salar)的95.6%(Norris et al, 2000)、黄河鲤(Cyprinus carpio)的93.82%(王新华 等, 2016)。一般认为, 当亲子鉴定能力超过80%时, 则认为该标记在亲子鉴定中具有应用价值(Chen et al, 2002)。此外, 本研究的亲子鉴定结果是建立在与真实系谱关系比较的基础之上的, 与只凭借分子数据进行模拟推算的亲子鉴定, 具有更高的可信度。因此, 本研究开发的9个微卫星标记组合能够有效地用于黄鳍棘鲷亲子鉴定, 为黄鳍棘鲷系谱分析和种质资源鉴定提供参考。

3.2 黄鳍棘鲷增殖放流效果评估

开展增殖放流效果评估, 能够为下一步增殖放流工作的实施提供参考(冯晓婷 等, 2019)。本研究利用“亲本标记开发—增殖放流与回捕—亲子鉴定”的系统方法, 评估了厦门湾黄鳍棘鲷大规模的增殖放流效果。结果显示, 7个微卫星位点在回捕个体中均具有高度多态性和丰富的遗传信息。其中有4个位点偏离了哈迪-温伯格平衡, 表明厦门湾海域的黄鳍棘鲷群体存在未检测到的群体分层, 或者群体的亲本存在近交或选择性交配的现象。说明多年的增殖放流活动对厦门湾海域的野生黄鳍棘鲷的群体结构有一定的影响。在264尾厦门湾黄鳍棘鲷回捕样品中有8尾子代匹配到亲本, 占回捕样本总数的3.03%。与已有的鱼类增殖放流研究相比, 本研究回捕个体的贡献率有所偏低, 比如在开展的钱塘江上游黄尾鲴(Xenocypris davidi)增殖放流效果评估研究中, 放流群体对野生群体资源量贡献率为4.73%(郭爱环 等, 2022), 在开展的长江江苏段鲢(Hypophthalmichthys molitrix)增殖放流研究效果评估中, 放流群体对野生群体资源量贡献率为8.21%(杨习文 等, 2020); 在开展的长江中上游胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)增殖放流效果评估研究中, 放流群体对野生群体资源量贡献率为16.92%(成为为 等, 2014)。本研究鉴定出的放流个体数量偏少的原因可能有: 回捕数量和放流总数相比太少, 2023年在厦门湾海域共放流480万尾黄鳍棘鲷的幼苗, 实验所用回捕个体数量只有264尾; 增殖放流的厦门湾为开放性海域, 面积太大, 鱼类群体的分布范围广, 放流个体回捕的概率较小; 回捕点设置太少, 放流活动在全厦门湾海域进行, 但本研究只设置了5个回捕点。综上说明本次增殖放流的黄鳍棘鲷个体在厦门湾海域存在一定数量, 通过增殖放流活动增加了厦门湾海域黄鳍棘鲷的资源量, 为黄鳍棘鲷渔业资源保护作出贡献。

4 结论

本研究初步建立了基于9个微卫星位点的黄鳍棘鲷亲子鉴定技术(亲子鉴定成功率>97%), 利用其中7个微卫星位点对厦门湾海域黄鳍棘鲷增殖放流效果进行评估, 结果显示: 回捕个体中有8尾黄鳍棘鲷为放流个体, 占回捕总数的3.03%, 表明增殖放流对厦门湾海域黄鳍棘鲷野生群体有一定贡献。本研究可为渔业渔政部门制定黄鳍棘鲷增殖放流政策、开展种质资源鉴定及保护提供科学依据。

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