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Journal of Tropical Oceanography >

2025 , Vol. 44 >Issue 1: 162 - 171

DOI: https://doi.org/10.11978/2024193

Marine Environmental Science

Study of acute toxicity of Karenia hui on Artemia salina and its hemolytic activity

  • CHEN Shibing , 1 ,
  • HUANG Bozhu 2 ,
  • XIE Xuedong 2 ,
  • ZHAO Jinping 2 ,
  • LYU Songhui 1 ,
  • CEN Jingyi , 1
Expand
  • 1. Research Center of Harmful Algae and Marine Biology, Jinan University, Guangzhou 510632, China
  • 2. Guangdong Ecological and Environmental Monitoring Center, Guangzhou 510308, China
CEN Jingyi. email:

Copy editor: SUN Cuici

Received date: 2024-10-15

  Revised date: 2024-10-23

  Online published: 2024-11-05

Supported by

National Key Research and Development Program of China(2022YFC3105201)

Construction of a Phytoplankton Biodiversity Database for Typical Water Sources Based on Environmental DNA Technology

Guangdong Provincial Key R&D Program(2023B1111050011)

Fold

Abstract

Karenia harmful algal blooms occur frequently worldwide, attracting extensive attention from countries around the globe. Karenia hui, identified as a new species of the genus Karenia in 2024, has been found to be lethal to Oryzias melastigma. Research on this species is currently quite limited. This study investigated its growth characteristics, acute toxicity on Artemia salina, and hemolytic activity at different growth stages. This study aims to reveal the growth curve of K. hui, its toxic effects, and changes in hemolytic activity. The results indicated that K. hui had a unique growth cycle. After the initial exponential growth period and the stable period, it entered the exponential growth period and the stable period again. Karenia hui possessed acute toxicity to Artemia salina, with the death rate of Artemia salina being positively correlated with the density of the algae and increasing with exposure time. In the study of the acute toxicity of K. hui at different growth stages to Artemia salina, the toxicity was the highest on day 23 of the initial stationary phase. The specific death rate of Artemia salina reached its peak at (0.22±0.03)h-1 within 24 hours, and the death rate after 72 hours reached (98.33±4.08)%. The hemolytic activity of K. hui increased during the first exponential growth phase and reached its peak at the end of this phase (14.43×10-6 HU·cells-1). It began to decline during the first stationary phase, and remained low during the second exponential growth phase and stationary phase (0.31×10-6 HU·cells-1). The results of this study can provide a foundation for assessing and mitigating the potential ecological risks posed by K. hui blooms.

Key words： Karenia; Karenia hui; acute toxicity; hemolytic activity

Cite this article

CHEN Shibing , HUANG Bozhu , XIE Xuedong , ZHAO Jinping , LYU Songhui , CEN Jingyi . Study of acute toxicity of Karenia hui on Artemia salina and its hemolytic activity[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2025 , 44(1) : 162 -171 . DOI: 10.11978/2024193

凯伦藻属(Karenia)隶属于裸甲藻目(Gymnodiniales)凯伦藻科(Kareniaceae)。凯伦藻作为有害藻华肇事种, 所引发的有害藻华事件在美国、日本、新西兰、智利、中国、澳大利亚等地均有报道(Brand et al, 2007, 2012; Chen et al, 2021; Vellojin et al, 2023)。当凯伦藻爆发藻华时, 其快速增殖的高密度藻细胞会导致水体缺氧, 部分凯伦藻细胞不仅具有溶血活性, 还能产生毒素, 这些因素均可导致海洋生物的死亡, 对渔业生产造成巨大损失(Brand et al, 2012)。凯伦藻属最常见的有害藻华肇事种为米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)及短凯伦藻(K. brevis)(Brand et al, 2012; Li et al, 2019)。米氏凯伦藻最早于1935年报道于日本, 自此之后, 在各大洲海域均有发现(Li et al, 2019), 其可产生溶血毒素及可导致海洋生物死亡的鱼毒素(Chen et al, 2021), 2012年, 日本Bungo海域发生米氏凯伦藻赤潮, 造成养殖渔业高达1530万美元的经济损失(Aoki et al, 2017)。2005年在爱尔兰西部海域由于米氏凯伦藻赤潮而导致水体缺氧, 造成大量底栖生物死亡(Davidson et al, 2009)。短凯伦藻为美洲墨西哥湾有害藻华常见的肇事种, 其在美国佛罗里达州西海岸几乎每年都会引发赤潮(Turley et al, 2022)。短凯伦藻可产短裸甲藻毒素(brevetoxins), 该毒素除了威胁海洋生物外, 会在细胞破碎后通过气溶胶随海风进入陆地, 刺激沿岸人类和其他哺乳动物呼吸道, 对哮喘病等慢性呼吸道疾病患者造成威胁(Pierce et al, 2003)。1996—2005年间, 美国佛罗里达州西海岸多次爆发短凯伦藻赤潮导致大量濒危物种海牛死亡, 1987—1988年该地大规模宽吻海豚灭绝事件也被认为与短裸甲藻毒素有关(Landsberg et al, 2009)。除此之外, 鞍形凯伦藻(K. selliformis)近年来也不断引发藻华。2021年9月爆发于日本北海道东部太平洋沿岸的鞍形凯伦藻赤潮, 对当地养殖业造成高达819万美元的经济损失(Iwataki et al, 2022)。2020年秋季, 俄罗斯堪察加半岛发生的鞍形凯伦藻赤潮, 造成了大量鱼类死亡, 赤潮发生时海边游客出现干咳、头晕、恶心、腹泻等症状(Orlova et al, 2022)。
经过多年的研究发现, 在我国海域中共记录有5种凯伦藻, 分别为米氏凯伦藻、鞍形凯伦藻、蝶形凯伦藻(K. papilionacea)、长沟凯伦藻(K. longicanalis)和胡氏凯伦藻(Lu et al, 2014; Cen et al, 2024)。其中米氏凯伦藻是我国近岸有毒有害藻华第二大肇事种(严冰 等, 2022)。我国首次大规模米氏凯伦藻藻华暴发于1998年, 发生在我国南海大鹏湾、大亚湾及珠江口海域(Lu et al, 2004), 1998—2017年, 中国沿海发生共记录米氏凯伦藻藻华137起, 发生时间集中在5、6月份(Chen et al, 2021)。1998年于珠江口海域暴发的米氏凯伦藻赤潮给当地渔业养殖业造成高达3亿元损失(陈宝红 等, 2015)。仅2012年, 福建近岸海域米氏凯伦藻藻华发生频率高达10起, 对当地的鲍鱼养殖业造成经济损失高达20.11亿元(Li et al, 2017)。
胡氏凯伦藻为本课题组于2024年鉴定的凯伦藻属新种(Cen et al, 2024)。相较于其他凯伦藻种类, 胡氏凯伦藻纵沟入侵较宽, 其细胞上锥部呈圆锥形, 其顶沟边缘凸起, 侧面观呈驼背状(Cen et al, 2024)。在对海洋青鳉鱼(Oryzias melastigm)的急性毒性研究中, 当其细胞密度为3×104cells·mL-1时, 在24h内可使海洋青鳉鱼全部致死, 其毒性仅次于鞍形凯伦藻, 显著高于米氏凯伦藻和长沟凯伦藻, 但并未在胡氏凯伦藻检测到裸甲藻毒素(gymnodimines, GYMs)(Cen et al, 2024), 因此, 该新种的毒性效应和致毒机制仍尚不清楚, 亟待进一步研究。
本论文通过研究胡氏凯伦藻的生长特性、对卤虫的急性毒性作用以及不同生长阶段的溶血活性, 旨在揭示凯伦藻新种胡氏凯伦藻的生长周期特征、毒性效应和溶血活性的变化规律, 评估胡氏凯伦藻的潜在生态危害。

1 材料和方法

1.1 实验藻种与培养

胡氏凯伦藻(株系号: RCHA6401, 于2021年12月分离自坝光湾)与东海原甲藻(Prorocentrum donghaiensie)(株系号: RCHA221-1)均由暨南大学藻类种质资源库提供。实验用藻均使用盐度28‰ 的L1培养基培养(Guillard et al, 2003), 培养条件为: 温度为23°C, 光暗周期12h∶12h, 光照强度100μmol·m-2·s-1。

1.2 生长曲线和光合速率测定

实验的初始藻密度为0.31×104cells·mL-1, 藻液培养体积为1.5L。每2日于上午11点采集藻液, 使用鲁哥氏剂液固定, 藻液震荡摇匀, 取0.1mL使用浮游植物计数框计数, 重复计数三次。绘制藻细胞生长曲线, 计算其生长速率。同时, 混匀后取藻液1mL, 黑暗处5min, 使用水体叶绿素荧光仪(AquaPen AP-10)测定藻细胞的最大光化学效率(Fv/Fm), 重复计数3次。
藻细胞生长速率∆c(单位: cells·d-1)计算公式如下:
$\Delta c=\frac{{{N}_{t}}-{{N}_{0}}}{t}$
式中, Nt为生长末期藻细胞密度; N0为起始藻密度; t为N0到Nt的时间间隔(d) 。

1.3 胡氏凯伦藻对卤虫急性毒性测定

1.3.1 不同密度胡氏凯伦藻对卤虫急性毒性

选取处于指数生长期的胡氏凯伦藻, 设置为低、中、高密度组进行卤虫实验, 实验组藻细胞密度依次为 500、2500和25000cells·mL-1。

1.3.2 不同生长时期胡氏凯伦藻对卤虫急性毒性

选取培养5、10、15、23、31和39d的藻液, 设置低密度组(500cells·mL-1)、高密度组(5000cells·mL-1)进行卤虫实验。
实验1.3.1和1.3.2均在12孔培养板中进行, 选取孵化时间为1d, 生长状况均等且活力良好的卤虫, 每孔10只, 设置6个平行, 实验藻液体积为5mL。卤虫孵化条件为: 盐度28‰的L1培养基, 温度为23°C。实验1.3.1和1.3.2均使用无毒的东海原甲藻作为阴性对照组, 使用天然海水作为空白对照组, 实验体积均为5mL, 培养条件同1.1。
卤虫30s无反应则判定其死亡, 卤虫死亡率d (单位: %)和比死亡速率μ (单位: h-1)计算公式如下:
$d=\frac{{{W}_{t}}}{10}\times 100%$
$\mu =\frac{{{W}_{t}}-{{W}_{0}}}{t}$
式中, Wt为暴露t时间卤虫死亡数; W0为暴露初期卤虫死亡数; t为W0到Wt的时间间隔(h) 。

1.4 溶血活性测定

纯培养藻株的溶血毒素的提取方法及测定参照 (Eschbach et al, 2001; 周成旭 等, 2007)。取接种后5d (0.58×104cells·mL-1)、10d (0.84×104cells·mL-1)、15d (0.92×104cells·mL-1)、23d (1.01×104cells·mL-1)、31d (1.39×104cells·mL-1)、39d (1.42×104cells·mL-1)、47d (1.47×104cells·mL-1)的藻细胞各20mL, 离心(10000r·min-1, 10min)后收集藻细胞, 将收集的藻细胞重悬于400µL溶血缓冲液中, 于超声破碎仪(BRANSON digital sonifier 250)冰浴下破碎藻细胞(破碎功率10%, 时长5min, 脉冲2s, 间隔1s)。
取1mL EDTA抗凝兔血溶于等体积的兔血缓冲液中, 离心10min (1000r·min-1), 重复洗涤3次, 以兔血缓冲液为溶剂, 配制成2%的兔血红细胞溶液。向1.5mL离心管中加入30µL溶血毒素提取液, 80µL 2%的兔血红细胞和90µL兔血缓冲液。30°C, 震荡水浴1h反应。反应结束后4°C, 离心10min(1000 r·min-1), 取150µL上清液于96孔酶标板中, 使用酶标仪(CLARIOstar, BMG Labtech)测定540nm处溶血吸光值, 计算每株藻的溶血活性。实验采用洋地黄皂苷(digitonin)作为溶血标准物绘制标准曲线, 以兔血缓冲液作为零溶血对照, 以1%Triton X-100作为全溶血对照, 以灭菌后的海水作为空白对照, 每组设置3个平行。
单藻细胞溶血活性计算公式(彭颖慧 等, 2009), 溶血活性百分数H(单位: %)及溶血活性HU(单位: HU·cells-1)计算公式如下:
$H=\frac{{{A}_{\text{w}}}-{{A}_{0}}}{{{A}_{\text{c}}}-{{A}_{0}}}$
$\text{HU}=\frac{\frac{{{A}_{\text{w}}}-{{A}_{\text{0}}}}{{{A}_{\text{c}}}-{{A}_{0}}}-b}{a\times \text{E}{{\text{C}}_{50}}}\times \frac{m}{V}\times \frac{n}{\text{ACD}}$
式中, Aw: 样品溶血后所测得的吸光值; A0: 空白对照的吸光值; Ac: 全溶血的吸光值; EC50: 方程(4)中, 当y=50 时的x值, 即当溶血百分比为50%时的洋地黄皂甙浓度(μg·mL-1); a: 方程(4)中拟合直线的斜率; b: 拟合直线的截距; m: 溶血毒素缓冲液与培养基的体积比; V: 加入反应体系的毒素体积(mL); n: 实际反应体系的体积与1mL的比值; ACD: 藻细胞密度 (cells·mL-1)。

1.5 统计分析

使用Origin2023软件绘图, 实验数据采用IBM SPSS Statistics26软件进行统计学分析, 实验数据采用单因素和多因素方差分析(ANOVA), 多重比较检验采用fisher’s least significant difference(LSD)法, 当P< 0.05时为差异显著。

2 结果

2.1 胡氏凯伦藻的生长特性

通过对胡氏凯伦藻进行50d细胞密度测定, 绘制生长曲线并作拟合曲线如图1所示, 胡氏凯伦藻在接种后50d内细胞密度总体呈上升趋势, 在50d的观察中, 藻细胞密度增长缓慢, 胡氏凯伦藻细胞密度从初始的0.31×104cells·mL-1经过17d生长至1.02×104cells·mL-1, 之后细胞密度趋于稳定, 维持在1.00×104cells·mL-1左右, 25~35d细胞密度再次上升, 35d后增长再次放缓, 之后细胞密度在1.39×104~1.57×104cells·mL-1浮动, 在培养43天时密度达到最高, 为1.57×104cells·mL-1。计算其培养不同时间段生长速率及最大光化学效率(Fv/Fm)(图2), 得到以下结果, 1~17d藻细胞生长速率为411.23cells·d-1, 最大光化学效率由0.29开始增长并稳定在0.40左右。17~25d藻细胞生长速率为30.82cells·d-1, 最大光化学效率由0.42下降至0.27。25~35d、35~50d藻细胞生长速率分别为 373.33cells·d-1和-4.81cells·d-1, 25~50d藻细胞最大光化学效率再次上升至0.50左右。在本实验中藻细胞最大光化学效率变化范围为0.26~0.50, 最高出现在培养第49天为0.50, 最低出现在培养第27天, 为0.26。在50d的培养中, 藻细胞出现两次指数生长期, 分别为培养1~17d和25~35d, 出现了两次稳定期, 为培养17~25d和35~50d。第二次指数生长期生长速率低于首次指数生长期。
图1 胡氏凯伦藻生长曲线

Fig. 1 Growth curve of Karenia hui

图2 胡氏凯伦藻光合速率

Fig. 2 Fv/Fm of Karenia hui

2.2 不同密度胡氏凯伦藻对卤虫的致死率

胡氏凯伦藻纯培养藻液对卤虫96h急性毒性结果显示, 三种密度纯培养藻液均对卤虫具有致死性, 死亡率与藻液密度呈正相关(图3)。在暴露于藻液3h后, 高密度组卤虫开始死亡, 死亡率为3.33%。而低密度组和中密度组卤虫死亡现象出现于暴露后6h, 死亡率分别为1.67%和3.33%。在暴露后12h, 高密度组卤虫死亡率显著高于中、低密度组(单因素方差分析, LSD事后检验, P<0.05), 24~48h结果显示, 低、中、高密度组间卤虫死亡率均具有显著差异(P<0.05), 且显著高于对照组与饥饿组(P<0.05)。比死亡速率结果(表1)表明中密度和高密度组卤虫比死亡速率在24h内最高, 分别为0.19h-1、0.26h-1, 而低密度组比死亡速率在48~72h达到最高, 为0.12h-1, 不同密度胡氏凯伦藻和不同暴露时间均对卤虫的比死亡速率有显著影响(多因素方差分析, LSD事后检验, P<0.05)。
图3 不同密度胡氏凯伦藻暴露下卤虫死亡率

不同字母代表同一暴露时间, 不同组之间有显著差异(P<0.05)

Fig. 3 The death of Artemia salina under exposure to different concentrations of Karenia hui. Different letters indicate significant differences among different groups at the same exposure time (P<0.05)

表1 不同密度胡氏凯伦藻暴露下卤虫比死亡速率(h-1)

Tab. 1 The specific death rate of Artemia salina under exposure to different concentrations of Karenia hui (h-1)

时间段 比死亡速率(h-1)
低密度组 中密度组 高密度组 对照组 饥饿组
0—24h 0.11±0.03a 0.19±0.04b 0.26±0.02c 0.03±0.02d 0.03±0.02d
24—48h 0.10±0.02a 0.11±0.04a 0.13±0.03a 0.01±0.02b 0.04±0.03b
48—72h 0.12±0.04a 0.08±0.04a 0.02±0.02b 0.02±0.02b 0.01±0.01b
72—96h 0.08±0.03a 0.03±0.03bc 0.00±0.00b 0.04±0.03c 0.02±0.02bc

注: 不同字母表示同一暴露时间, 不同组间存在显著差异(P<0.05)

2.3 不同生长时期胡氏凯伦藻对卤虫的致死率

本实验对不同培养天数胡氏凯伦藻对卤虫致死率结果如图4。低密度组(500cells·mL-1)藻液暴露时, 培养23d的藻液对卤虫的致死率最高, 暴露6h、12h、24h、48h和72h的死亡率分别为(3.33%±5.16)%、(13.33%±8.16)%、(46.67%±5.16)%、(71.67%±7.52)%、(96.67%±5.16)%。高密度组(5000cells·mL-1)藻液暴露时, 培养23d组胡氏凯伦藻对卤虫死亡率最高, 暴露12h、24h、48h和72h的死亡率分别为(23.33%±10.32)%、(53.33%±8.16)%、(78.33%±14.72)%、(98.33%±4.08)%。在实验24~96h, 各实验组均显著高于饥饿组(单因素方差分析, LSD事后检验, P<0.05), 不同培养天数组差异不显著(单因素方差分析, LSD事后检验, P>0.05)。
图4 不同生长时期胡氏凯伦藻暴露下卤虫死亡率

“*” 表示该组与饥饿组具有显著差异(P<0.05), a—f分别为培养5、10、15、23、31和39d胡氏凯伦藻暴露下卤虫死亡率

Fig. 4 The death rate of Artemia salina exposed to Karenia hui at different growth stages. “*” indicates significant difference between the study group and the control group (P<0.05), a−f represent the death rates of Artemia salina exposed to K. hui on day 5, 10, 15, 23, 31, and 39 of cultivation, respectively

不同暴露时间下卤虫死亡数的比死亡速率见表2。暴露于低密度藻细胞时(500cells·mL-1), 培养5~23d的藻细胞对卤虫比死亡速率在暴露24h内最高, 而培养31d和39d的藻细胞对卤虫比死亡速率在暴露24~48h最高。在实验24h内, 23d组卤虫比死亡速率显著高于其他实验组(单因素方差分析, LSD事后检验, P<0.05)。于高密度藻细胞(5000cells·mL-1)暴露时, 各实验组卤虫比死亡速率均在24h内达到最高。胡氏凯伦藻在24h内对卤虫表现出显著的急性毒性。对不同生长时期胡氏凯伦藻暴露下卤虫比死亡速率进行多因素方差分析, 结果表明不同生长时期的胡氏凯伦对卤虫的比死亡速率无显著差异(多因素方差分析, LSD事后检验, P=0.992), 而不同暴露时间对卤虫比死亡率有显著影响(多因素方差分析, LSD事后检验, P<0.05)。
表2 不同培养天数胡氏凯伦藻暴露下卤虫比死亡速率(h-1)

Tab. 2 The specific death rate of Artemia salina exposure to Karenia hui for different culture days (h-1)

时间段 密度
组别		 不同培养天数下的比死亡速率(h-1)
5d 10d 15d 23d 31d 39d
0—24h 低 0.13±0.03a 0.13±0.04a 0.15±0.04a 0.19±0.02b 0.12±0.03a 0.13±0.05a
高 0.18±0.02ab 0.17±0.03ab 0.20±0.03bc 0.22±0.03c 0.15±0.03a 0.17±0.03ab
24—48h 低 0.11±0.04a 0.13±0.06a 0.13±0.07a 0.10±0.04a 0.15±0.03a 0.14±0.06a
高 0.12±0.04a 0.13±0.03a 0.11±0.07a 0.10±0.06a 0.15±0.03a 0.13±0.05a
48—72h 低 0.06±0.06ab 0.06±0.04a 0.10±0.02abc 0.10±0.04abc 0.11±0.03bc 0.13±0.05c
高 0.06±0.04a 0.07±0.04a 0.08±0.07a 0.08±0.07a 0.08±0.06a 0.09±0.03a
72—96h 低 0.10±0.07a 0.10±0.03a 0.03±0.04b 0.01±0.02b 0.04±0.04b 0.03±0.02b
高 0.04±0.03a 0.04±0.04a 0.02±0.02a 0.01±0.02c 0.03±0.03a 0.02±0.02a

注: 不同字母表示同一暴露时间, 不同培养天数组间存在显著差异(P<0.05)

2.4 不同生长时期胡氏凯伦藻的溶血活性

通过对不同培养天数的胡氏凯伦藻溶血活性测定, 结果见图5。培养5~23d的细胞液具有溶血活性, 培养31~47d的细胞液溶血活性较低。在培养时间5~23d, 藻细胞的溶血活性呈先上升后下降趋势。对不同生长时期胡氏凯伦藻溶血活性进行单因素方差分析, 培养5d的藻细胞溶血活性为6.12×10-6HU·cells-1, 随后升高在培养15d的藻细胞溶血活性最高为14.43×10-6HU·cells-1, 显著高于其他组别(单因素方差分析, LSD事后检验, P< 0.05), 培养31d后的藻细胞溶血活性降到最低(0.31×10-6~0.42×10-6HU·cells-1)。
图5 不同生长时期胡氏凯伦藻溶血活性

不同字母表示不同培养时期藻细胞溶血活性存在显著差异(P<0.05)

Fig. 5 Hemolytic activity of K. hui at different growth stages. Different letters indicate that there are significant differences in hemolytic activity of K. hui at different cultivation periods (P<0.05)

3 讨论

胡氏凯伦藻的生长周期较长, 呈双指数生长期的生长特性。藻细胞在培养初期的17d内为指数生长期, 随后进入了为期8d的稳定期。在培养周期的第25d, 藻细胞再次进入指数生长期, 这一阶段大约持续了10d。从第35d起, 细胞生长进入了稳定期, 一直持续到第50d。凯伦藻的培养周期大约为30d, 停滞期约3~8d、指数生长期约17d、稳定期持续7d左右、衰退期时间较短, 约2~4d(崔伟民 等, 2009; Zhao et al, 2017; Tilney et al, 2019; Tang et al, 2021)。胡氏凯伦藻在本实验中未表现出明显的停滞期, 其首次指数生长期和稳定期时间与凯伦藻属相吻合。与其他凯伦藻在稳定期后藻细胞密度迅速下降的现象相反, 胡氏凯伦藻在指数生长期和稳定期后, 藻细胞密度会再次升高, 而后达到稳定。在本研究中胡氏凯伦藻密度最高达到1.57×104cells·mL-1, 而之前的研究中, 凯伦藻最高密度可达到2.20×104~1.18×105cells·mL-1(崔伟民 等, 2009; Tatters et al, 2010; Tang et al, 2021)。在对藻细胞生长状态评估时, 其最大光化学效率(Fv/Fm)与生长曲线相吻合(Saeck et al, 2016; Tan et al, 2019)。胡氏凯伦藻在指数生长期时最大光化学效率上升并稳定在0.40左右, 表明藻细胞在培养1~17d生理活性良好, 此时的生长速率也较高, 达到411.23cells·d-1, 藻细胞快速生长。藻细胞在培养17d后最大光化学效率出现下降的趋势, 该阶段藻细胞生长速率较低, 为30.82cells·d-1, 此时藻细胞生理活性下降, 藻细胞密度稳定, 表明胡氏凯伦藻在17~25d处于稳定期。藻细胞最大光化学效率在25~27d达到最低, 在27d藻细胞最大光化学效率再次上升, 而此时藻细胞密度也逐渐上升, 此时藻细胞生长速率为373.33cells·d-1, 表明此时胡氏凯伦藻再次处于指数生长期。从生长周期细胞密度和最大光化学效率的变化, 表示胡氏凯伦藻具有双指数生长期, 在其他凯伦藻中并未发现这一现象(Zhao et al, 2017; Tilney et al, 2019; Tang et al, 2021)。胡氏凯伦藻具有双指数生长期可增强其与其他藻类竞争中的优势, 这种生长模式可能使胡氏凯伦藻在资源可用时快速占据生态位。胡氏凯伦藻出现这一特殊的生长周期还需要进一步研究。
在Cen等(2024)的研究中, 胡氏凯伦藻密度在3.00×104cells·mL-1对海洋青鳉鱼具有高致死性, 但目前胡氏凯伦藻对其他浮游生物的毒性不清楚。本研究发现, 0.05×104~2.50×104cells·mL-1密度胡氏凯伦藻均对卤虫致死, 致死率随密度升高而增高, 其中24h致死率为26%~63%, 96h全部致死, 这表明胡氏凯伦藻对卤虫同样具有毒性。先前已有研究发现米氏凯伦藻密度在3.00×104cells·mL-1时, 卤虫暴露72h和96h后死亡率分别为17%、23%(Li et al, 2017)。而孙等发现1.00×104cells·mL-1的米氏凯伦藻在96h可使卤虫死亡率达到90%左右(孙科 等, 2010), 也有报道短凯伦藻、短沟凯伦藻(K. brevisulcata)和米氏凯伦藻在高密度下(106cells·mL-1)均对卤虫无明显致死现象(Botes et al, 2003; Shi et al, 2012; Li et al, 2017), 这说明与其他凯伦藻相比, 本株系胡氏凯伦藻对卤虫具有较高的毒性。本研究还发现不同培养时间的胡氏凯伦藻均对卤虫均具有较高的致死性, 且培养23d的胡氏凯伦藻对卤虫的致死率最高, 说明首次达到稳定期胡氏凯伦藻对卤虫毒性最强。在本研究发现, 胡氏凯伦藻藻密度在103cells·mL-1和104cells·mL-1时, 卤虫比死亡速率在暴露24h达到最高, 且卤虫比死亡速率随藻密度升高而增加, 在孙的研究中, 米氏凯伦藻(103cells·mL-1和104cells·mL-1)对卤虫比死亡速率在24h内最低, 在48~72h达到最高(孙科 等, 2010)。这说明相较于米氏凯伦藻, 胡氏凯伦藻在24h内对卤虫具有快速致死效应。
凯伦藻属多个物种具有溶血活性, 如短凯伦藻、米氏凯伦藻、鞍形凯伦藻、长沟凯伦藻和蝶形凯伦藻等(Tatters et al, 2010; Zou et al, 2010; 林雅柔 等, 2020)。在本研究中, 胡氏凯伦藻溶血活性百分数最高可达49.62%, 林雅柔等测得长沟凯伦藻、鞍形凯伦藻、米氏凯伦藻、蝶形凯伦藻的溶血活性百分数分别为46.36%、42.33%、37.81%、37.02%(林雅柔 等, 2020), 与其他凯伦藻相比, 胡氏凯伦藻具有较高的溶血活性。本研究发现, 胡氏凯伦藻整个生长周期中, 其溶血活性发生变化。在其他藻中也出现整个生长周期中溶血活性变化的情况, 如卵圆卡盾藻(Chattonella ovata)在衰亡期溶血活性最高, 稳定期溶血活性最低(江涛 等, 2012), 海洋卡盾藻(C. marina)和赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)溶血活性在指数生长期达到最高, 之后随培养时间延长而逐渐降低, 球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)和小普林藻(Prymnesium parvum)溶血活性峰值则出现在稳定期(彭喜春 等, 2005; 曹洁茹 等, 2015)。胡氏凯伦藻溶血活性在首次指数生长期逐渐升高, 在首次指数生长期末期达到最高。首次稳定期时, 胡氏凯伦藻溶血活性开始下降, 第二次指数生长期和稳定期时, 藻细胞溶血活性较低。海洋微藻所产的溶血物质多为多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)(Fu et al, 2004; 陈宝红 等, 2015), 藻细胞增殖过程中随着代谢方式变化, 其能量配额发生转变以利于藻细胞生长(Chakraborty et al, 2019), 在这个过程中, 脂肪酸可能会被作为能量来源消耗, 以支持细胞的生长, 这可能是导致藻细胞在第二次指数生长期和稳定期溶血活性降低的原因。
本研究结果发现胡氏凯伦藻的溶血活性强弱对卤虫的急性毒性并不影响, 目前已确定米氏凯伦藻所产溶血活性物质是2种脂多糖和1种脂质的混合物(Yang et al, 2011), 且其产生的溶血活性物质会对鱼鳃具有毒性作用(Sola et al, 1999), 可使鱼鳃出现鳃小叶上皮细胞增生、邻近鳃小叶粘连上皮细胞脱落、鳃血管破裂、血细胞渗出等组织病理(王朝晖 等, 2001)。目前已发现胡氏凯伦藻对海洋青鳉鱼具有强毒性(Cen et al, 2024), 但其致死机制尚不清楚, 胡氏凯伦藻可能是通过产生溶血活性物质损伤鱼鳃, 从而导致鱼的死亡。不同溶血藻类的溶血物质的结构和作用机制差异很大(Kuroda et al, 2005; Zou et al, 2010), 本研究结果中初次稳定期的胡氏凯伦藻对卤虫致死率最高, 但其溶血活性峰值却出现在初次指数生长末期, 可能是由于卤虫的生理结构的差异性导致其对溶血活性物质敏感性不同。在已有的研究中发现, 米氏凯伦藻和鞍形凯伦藻可产生多种毒素(Brand et al, 2012; Li et al, 2019), 胡氏凯伦藻在生长过程中, 除了产生溶血活性物质外, 还可能会产生其他毒素, 因此本研究中卤虫在初次稳定期死亡率最高可能是多种因素共同作用的结果。想要确定其溶血活性物质结构十分困难, 目前对胡氏凯伦藻产生的溶血活性物质仍需要进一步探究。
本研究中的胡氏凯伦藻分离自深圳坝光湾, 其在野外已经形成鱼毒性赤潮(本实验室未发表数据)。在整个生长周期中, 首次达到稳定期的胡氏凯伦藻对卤虫毒性最强, 且其首次指数生长期和首次稳定期均表现出较高的溶血活性, 这两个阶段的胡氏凯伦藻可能对海洋生物具有较大威胁。因此, 我们对自然环境中胡氏凯伦藻密度变化的监测具有重要意义。

4 结论

本文通过研究胡氏凯伦藻的生长特性发现胡氏凯伦藻具有一个独特的生长周期, 包括两个指数生长期和两个稳定期。通过胡氏凯伦藻对卤虫急性毒性实验发现, 胡氏凯伦藻在整个生长周期中, 均对卤虫表现出致死作用急性毒性, 在首次稳定期, 其对卤虫致死率最高, 且卤虫的死亡率与藻细胞的密度呈正相关。此外, 通过探究不同生长时期胡氏凯伦藻溶血活性发现, 其在生长初期具有较高的溶血活性, 在首次指数生长期后期达到峰值, 随后显著下降。

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