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Journal of Tropical Oceanography >

2025 , Vol. 44 >Issue 3: 179 - 187

DOI: https://doi.org/10.11978/2024190

Marine Environmental Science

Dynamic analysis of particle-adsorbed oxylipins in typical coastal diatoms and their application in bloom monitoring*

  • YANG Yang , 1, 2 ,
  • WU Zhengchao , 1 ,
  • CHENG Yuanyue 1 ,
  • WU Meilin 1 ,
  • LI Qian , 1, 3
Expand
  • 1. State Key Laboratory of Tropical Oceanography (South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences), Guangzhou 510301, China
  • 2. College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
  • 3. Guangdong Key Lab of Ocean Remote Sensing (South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences), Guangzhou 510301, China
WU Zhengchao. email: ;
LI Qian. email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2024-10-12

  Revised date: 2024-11-13

  Online published: 2024-11-13

Supported by

Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation(2022B1515120030)

Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation(2022A1515010588)

Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation(2024A1515010938)

National Natural Science Foundation of China(42276162)

National Natural Science Foundation of China(42276130)

National Natural Science Foundation of China(41706181)

Fold

Abstract

Diatom oxylipins, as key infochemicals, play a significant role in driving biological interactions during coastal diatom blooms and may influence biogeochemical cycles throughout the bloom's life cycle. Oxylipins exist in three forms in water, with particle-adsorbed oxylipins in the phycosphere reaching micromolar concentrations, making them particularly impactful in ecological contexts. In this study, we focused on polyunsaturated aldehydes (PUAs), a crucial class of oxylipins, and developed a method for rapidly quantifying particle-adsorbed PUAs during diatom growth. The method involves measuring diatom particle volumes through settling and centrifugation, and simulating the natural processes of settling and sedimentation. We observed that particle volumes varied between 12%~49%. To avoid the production of new PUAs, we optimized a derivatization process using 5% sulfuric acid-dissolved 2, 4-dinitrophenylhydrazine (DNPH), replacing the traditional neutral buffer. Using ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC) paired with multiple reaction monitoring (MRM) in tandem mass spectrometry, we were able to achieve rapid separation and accurate quantification of PUAs within just 5 minutes. This method was applied to monitor the growth stages of three typical red tide diatom strains in the laboratory, preliminarily exploring dynamic patterns in particle-adsorbed and related PUAs throughout the diatom growth process. Our results revealed that the particle-adsorbed PUAs concentrations in all three strains reached micromolar levels, ranging from 0.4~69 μmol·L-1. Notably, Skeletonema costatum exhibited similar trends between particle-adsorbed and particulate PUAs, with concentrations staying at a low level in the exponential phase before rising significantly during the stationary phase. In contrast, Thalassiosira rotula showed a decline in particle-adsorbed PUAs concentrations during the stationary phase compared to the exponential phase. Additionally, the composition of particle-adsorbed PUAs varied, with S. costatum being dominated by heptadienal in the exponential phase. This study provides important insights for the in situ monitoring application of diatom oxylipins during blooms and their potential ecological and biogeochemical impacts.

Key words： diatom blooms; oxylipins; polyunsaturated aldehydes (PUAs); phycosphere; quantitative analysis

Cite this article

YANG Yang , WU Zhengchao , CHENG Yuanyue , WU Meilin , LI Qian . Dynamic analysis of particle-adsorbed oxylipins in typical coastal diatoms and their application in bloom monitoring*[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2025 , 44(3) : 179 -187 . DOI: 10.11978/2024190

硅藻是近海浮游植物藻华甚至赤潮的优势种群, 其生消演变对海洋食物网结构和生源要素循环有重要影响(Armbrust 2009; Malviya et al, 2016; 黄邦钦 等, 2021; Zhang et al, 2021; Ma et al, 2022)。在环境胁迫下, 硅藻膜脂中的多不饱和脂肪酸通过酶促反应(如脂氧合酶途径)(时免免 等, 2023), 生成一系列高活性的氧脂素(oxylipins), 例如多不饱和醛(polyunsaturated aldehydes, PUAs)(d'Ippolito et al, 2018), 这些代谢物作为信息化学物质调控藻群互作, 影响藻华或赤潮的演替过程(Miralto A, 1999; Ianora et al, 2010; Wang et al, 2021; Wu et al, 2023)。硅藻合成的氧脂素会以脉冲形式释放, 通过颗粒物表面进入藻际环境(Seymour et al, 2017), 并扩散至海水中。已知氧脂素在海水中存在颗粒态、颗粒吸附态和溶解态三种氧脂素形式(Wu et al, 2021a, 2023)(图1)。在水柱环境中, 颗粒态和溶解态氧脂素的浓度通常不超过nmol·L-1水平(Wu et al, 2016, 2021b)。然而, 由于颗粒物的存在, 水柱中氧脂素分布不均, 常在破损细胞或沉降的硅藻聚合体中累积。因此, 硅藻来源的颗粒物成为水柱中氧脂素的热点来源, 可形成高达μmol·L-1水平的颗粒吸附态PUAs(指颗粒物排开水体体积中的PUAs摩尔量)(Edwards et al, 2015; Wu et al, 2021b, 2023)。颗粒吸附态PUAs具有显著的生态和生物地球化学效应, 特别是在与藻际环境附生菌的相互作用中, 调控沉降颗粒物的细菌矿化、碳输出(Edwards et al, 2015)、低氧区细菌呼吸耗氧(Wu et al, 2021a), 以及近海藻华区的有机磷循环(Wu et al, 2023)。
图1 技术流程操作简图

Fig. 1 Schematic diagram of the technical workflow used in this study

硅藻前体分子含量和酶活性高度变异, 导致氧脂素代谢在物种、品系及藻株间具有特异性, 并受细胞生理状态和环境因素调控(Wichard et al, 2005a; Kuhlisch et al, 2017)。为定性或定量分析室内培养和现场样品中的硅藻PUAs, 已开发多种分析方法(Pohnert 2000; Wichard et al, 2005b; Cutignano et al, 2011; Kuhlisch et al, 2017)。特别是在现场实验中, PUAs浓度低且不稳定, 要求复杂样品制备和高灵敏度检测手段, 以直接测定过滤海水样品中的PUAs(Vidoudez et al, 2011)。目前, 气相色谱-质谱法已广泛应用于定量分析硅藻颗粒态PUAs (d'Ippolito et al, 2018)。该方法通过机械破碎诱导酶促合成PUAs, 并通过五氟苄基羟胺(pentafluorobenzyl hydroxylamine, PFBHA)衍生, 稳定PUAs于中性缓冲溶液中, 避免干扰酶促反应, 确保PUAs持续生成。随后, 通过有机萃取结合气相色谱-质谱联用技术检测(Wichard et al, 2005; Wu et al, 2016)。
相比之下, 关于藻际环境颗粒吸附态PUAs的定量研究仍较为有限。Edwards等(2015)首次使用2, 4-二硝基苯肼(2, 4-dinitrophenylhydrazine, DNPH)衍生化法分析硅藻海雪中的颗粒吸附态PUAs, 通过酸性抑制酶促反应避免破碎产生新PUAs。随后, 利用高效液相色谱-质谱测定颗粒吸附态PUAs含量并估算颗粒物体积, 首次定性证明藻源颗粒吸附态PUAs可达微摩尔水平(Edwards et al, 2015)。后续研究通过大体积过滤结合分步离心优化了定量方法(Wu et al, et al, 2021; Wu et al, 2023)。然而, 海洋现场观测的时空分布复杂, 现有方法难以全面捕捉水华过程中颗粒吸附态PUAs的变化, 限制了生态环境效应的评估。目前, 尚未对硅藻生长过程中的颗粒吸附态PUAs进行系统定量表征。
本研究旨在定量分析硅藻颗粒吸附态及相关形态PUAs在不同生长阶段的动态变化。我们优化了通过沉降和离心测定硅藻颗粒体积的方法; 并改进了在酸性条件下使用高溶解度的DNPH代替中性缓冲液进行PUAs衍生化的方法; 利用超高效液相色谱-质谱联用技术(ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS)进行高效分离和多重反应监测(multiple reaction monitoring, MRM), 我们发展了一种适用于硅藻生长过程中颗粒吸附态PUAs快速测量的方法, 为监测颗粒吸附态PUAs在藻华过程中的动态变化及其生态环境影响提供了理论支撑和技术保障。

1 材料与方法

1.1 实验设计流程

本研究通过实验室纯培养和叶绿素监测模拟硅藻生长过程, 测定硅藻颗粒体积的上下限变化。重点对生长过程中颗粒吸附态PUAs及相关形态进行样品制备, 并采用特定前处理和衍生化方法。随后, 利用UHPLC-MS/MS技术对PUAs的浓度和组成进行定量分析, 并处理数据, 勾勒硅藻生长过程中颗粒吸附态PUAs的动态变化(图1)。

1.2 硅藻藻种

本实验使用的海洋硅藻购自上海光语生物科技有限公司, 包括中肋骨条藻青岛株Skeletonema costatum GY-H11(GY-H11)、福建株S. costatum GY-H22(GY-H22)和圆海链藻Thalassiosira rotula GY-H23(GY-H23)。三者均为近海藻华(赤潮)的典型藻种(陈楠生 等, 2021; 郑承志 等, 2021), 均为广泛研究的能够合成PUAs的硅藻(Ribalet et al, 2007; Kuhlisch et al, 2017; Wu et al, 2023)。

1.3 硅藻生长过程

将上述硅藻接种于含f/2培养基和硅酸盐的无菌人工海水中, 培养条件为21℃, 光照强度100μmol·m²·s⁻¹, 光暗周期为12h∶12h。进行半连续培养, 每3~4d移除约30%的培养液, 并补充等量的无菌培养基, 以维持藻株的营养供给和适宜密度, 保持藻株处于指数生长期(Russo et al, 2021)。随后, 将预培养的指数增长期藻液接种至1L灭菌瓶中, 继续在相同条件下培养。实验模拟硅藻生长各个阶段, 其间监测第4d至第16d, 采集叶绿素a、藻源颗粒物体积和氧脂素(PUAs)等样品(图1)。
叶绿素a取样于第4、7、10、13、16d, 间隔捕捉硅藻不同生长阶段(GY-H23消退期除外)。取10mL藻液, 使用GF/F滤膜(Whatman)过滤, 滤膜包裹后于-80℃保存。叶绿素a提取用5mL 90%丙酮, 4℃避光萃取24h, 离心后使用Turner Design的Trilogy荧光仪测定(Parsons et al, 1984)。硅藻颗粒物样本定容于藻株稳定生长期采集; PUAs样品在第4、13、16d采集两株中肋骨条藻, 第4、13d采集圆海链藻, 具体采样和处理下文。

1.4 硅藻颗粒物体积测定

本实验采用两种方法测定硅藻颗粒物体积的上下限。
1)上限: 自然沉降法。取稳定期的三株硅藻藻液各50mL, 置于无菌离心管, 用封口膜覆盖并扎孔透气。室温静置6h, 去上清后转移沉降颗粒至无菌1.5mL带刻度离心管, 再静置6h至完全沉降。因沉降方向不均, 颗粒物可能聚集一侧。加入无颗粒海水至液面覆盖颗粒并达刻度线, 记录液面体积和加入海水的体积, 二者差即为颗粒物体积(单位: mL)。
2)下限: 离心法。取藻样50mL离心(5000r·min-1, 4min), 弃上清液后转至1.5mL离心管再离心。离心导致颗粒物-一侧集中, 按上述方法测定体积。此方法有助于分析硅藻颗粒物体积变化(图1)。

1.5 颗粒吸附态及相关形态PUAs样品制备

取15mL藻液至离心管, 加入苯甲醛内标(终浓度10μmol·L-1), 以5000r·min-1离心4min, 弃去上清液。参考并改进Edwards等(2015)的酸性DNPH衍生化方法制备颗粒吸附态PUAs(图1): 向湿沉淀藻体颗粒物中加入1mL去离子水(Milli-Q超纯水), 再加入1mL 200μmol·L-1的酸性DNPH (98%, Aladdin)溶液, 该溶液含有5%硫酸。硫酸使生物酶变性, 可避免因涡旋或后处理导致酶促反应产生新的PUAs。样品醛类化合物衍生化, 反应15min, 每5min涡旋一次, 超声3min, 静置1h充分反应。加入3mL去离子水和10mL正己烷, 室温下提取衍生物15min, 5min涡旋一次并超声3min, 除去水相。氮吹挥发溶剂, 复溶于0.5mL甲醇, 转移至色谱瓶中分析。
同时, 制备与颗粒吸附态PUAs相关颗粒态PUAs样品, 辅助分析颗粒吸附态PUAs在硅藻生长中的动态变化。颗粒态PUAs制备与颗粒吸附态类似, 加入DNPH前增加超声破壁步骤(图1): 样品置于50%功率的上海SXSONIC超声波细胞破碎仪中, 冰浴破壁2min, 水浴静置15min, 诱导酶促反应, 之后进行衍生化和萃取。

1.6 PUAs样品的液相色谱-质谱测定

目标PUAs(2, 4-庚二烯醛、2, 4-辛二烯醛、2, 4-葵二烯醛)和内标通过安捷伦1290 Infinity Ⅱ UHPLC与6470三重四级杆质谱仪(triple quadrupole mass spectrometrytriple quadrupole mass spectrometry, QQQ MS)联用进行MS/MS分析, 采用电喷雾离子化(ESI+)源, 注射体积20μL。色谱分离使用ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD柱(2.1mm×50mm, 1.8μm, 安捷伦), 柱温40℃。MRM模式下定量分析目标醛类化合物, 苯甲醛作为内标(图1)。氮气用作干燥和碰撞气体, 优化目标醛类化合物的MRM参数确保高灵敏度和特异性, 包括碎片离子对、锥孔电压、碰撞能量(表1、图2)。
表1 苯甲醛(内标)、多不饱和醛及其衍生物在UHPLC-MS/MS负离子化模式下的MRM参数

Tab. 1 MRM parameters of benzaldehyde (internal standard), PUAs and their derivatives under the negative ionization mode in UHPLC-MS/MS

化合物 简写 醛类化学结构(衍生前) 衍生物母离子
(一级质谱MS1)		 衍生物碎片离子对
(二级质谱MS2)		 锥孔电压/V 碰撞能/V
苯甲醛(内标) Ben 284.8 162.9 80 15
238.0 80 15
庚二烯醛 C7 288.9 162.9 80 15
229.9 80 15
241.9 80 15
辛二烯醛 C8 302.8 162.9 80 15
229.9 80 15
255.9 80 15
葵二烯醛 C10 330.9 162.9 80 15
229.9 80 15
284.9 80 15
图2 醛类标准品衍生物的UHPLC-MS/MS分析(多重反应监测模式MRM)结果

Fig. 2 UHPLC-MS/MS analysis (MRM mode) of aldehydes standard derivatives

为测定PUAs类化合物, 流动相A为0.1%甲酸(V/V)的70%乙腈+30%去离子水, 流动相B为0.1%甲酸(V/V)的乙腈(默克, 色谱纯)。梯度洗脱程序: 0min时45%B, 0.5min增至50%B, 1.0min增至55%B, 1.5min增至60%B, 2.0min增至65%B, 2.5min达到100%B, 3.0min降至65%B, 3.5min回到45%B, 总时长4.0min, 流速0.3mL·min-1, 柱子平衡时间3min。质谱条件: 气体温度350°C, 气流速3L·min-1, 雾化器压力35psi, 保护气流速11L·min-1, 保护气温度350°C, 喷嘴电压500V, 毛细管电压3500V。靶向碎片离子对的峰面积用于积分分析(图2)。检测限基于信噪比的三倍。
定量分析使用PUAs的标准曲线, 添加甲醇稀释PUAs储备液, 使用去离子水制备庚二烯醛(>90%, Aladdin)、辛二烯醛(95%, Sigma-Aldrich)和葵二烯醛(>90%, Aladdin)的标准系列(0~40nmol)。这些标准溶液按与样品处理一致, 最终获得15mL藻液样品中颗粒态和颗粒吸附态PUAs的摩尔含量。

1.7 颗粒吸附态及相关形态PUAs的数据分析

参考Wu等(2021a, 2023)对环境中PUAs浓度的定义。颗粒态PUAs浓度(cparticulate PUAs, 单位: mol·L-1)表示水柱中的背景浓度(均值), 为单位体积海水中的PUAs摩尔含量, 计算方法为cparticulate PUAs=nparticulate PUAs/Vf, 式中nparticulate PUAs为颗粒态PUAs摩尔含量, Vf为过滤藻液体积。颗粒吸附态PUAs浓度(cparticle-adsorbed PUAs, 单位: mol·L-1)则表示藻际环境中的局部浓度(热点), 为单位体积颗粒物置换出的海水中的PUAs摩尔含量, 计算方法为cparticle-adsorbed PUAs=nparticle-adsorbed PUAs/Ve, 式中nparticle-adsorbed PUAs为颗粒吸附态PUAs的摩尔含量, Ve为藻体颗粒物排开水体的体积, 由沉降法和离心法分别测定(见1.4部分)。

2 结果与讨论

2.1 硅藻生长中的叶绿素变化

通过叶绿素 a浓度动态监测三株硅藻的生长过程(图3)。GY-H11在第4d叶绿素a浓度较高[(82.69±2.56)μg·L-1], 表明前期生物量较大, 第7d至第10d快速上升, 于第13d达峰值[(219.72±5.13)μg·L-1], 第16d下降至(132.30±3.47)μg·L-1, 进入衰退期。GY-H11的叶绿素在衰退期仍保持较高水平, 可能与其较强的耐环境波动能力相关。GY-H22初始叶绿素a浓度较低[(36.35±1.87)μg·L-1], 第7d后进入平稳期, 第16d降至(26.72±1.90)μg·L-1, 表明藻株因营养限制或环境变化进入衰退。相较GY-H11, GY-H22生长较慢, 可能因为其生理特性和对实验条件适应性较弱。GY-H23初期浓度中等[(61.07±2.84)μg·L-1], 第7d快速上升至(162.92±4.39)μg·L-1, 第13d达高峰[(229.07±6.21)μg·L-1], 无明显衰退, 表明适应性强。三株硅藻的叶绿素 a变化差异反映了其适应性与生理特性。
图3 硅藻生长中的叶绿素a变化(生长曲线)

白色和黑色箭头分别是中肋骨条藻和圆海链藻的PUAs采样时间

Fig. 3 Changes in Chlorophyll-a during diatom growth. The white and black arrows indicate the PUAs sampling days for S. costatum and T. rotula, respectively

2.2 硅藻生长过程中的颗粒物体积差异

采用沉降法和离心法分别测定了三株硅藻的颗粒物体积上限和下限(图4)。GY-H11的离心法体积约为0.65mL·L-1, 沉降法为0.90mL·L-1(差异35%); GY-H22分别为1.10和1.65mL·L-1(49%差异); GY-H23分别为0.90和1.00mL·L-1(12%差异)(图4)。结果表明, 不同方法测得的颗粒物体积存在显著差异, 以GY-H22的差异最大, GY-H23最小。
图4 两种方法测得的硅藻颗粒物体积(a)及其状态(b)

Fig. 4 Diatom particle volume (a) measured by two methods and their corresponding states (b)

沉降法模拟自然海水中颗粒物缓慢沉降的过程, 颗粒物保持松散状态, 反映体积上限; 离心法通过高转速压实颗粒物, 模拟沉积层中受重力压实的状态, 代表体积下限。因此, 离心法测得的体积较小, 反映了颗粒物在沉积过程中的压实效应。颗粒物体积差异可能与藻株细胞结构、密度及沉降特性有关(Dunker et al, 2018)。在海洋环境中, 藻类颗粒的沉降和压实过程影响水柱代谢物浓度、微生物矿化及营养盐循环, 对生态系统产生影响(Edwards et al, 2015)。

2.3 颗粒吸附态及相关形态PUAs样品制备与液质联用定量

在本研究中(见1.6部分), 我们采用离心法收集硅藻生源颗粒物, 避免了过滤法可能导致的滤膜破裂问题。文献表明, 离心法在PUAs样品制备中更为准确(Russo et al, 2021)。本实验参考了Edwards等(2015)的方法, 使用DNPH作为衍生试剂。DNPH的肼基(NH-NH₂)作为亲核亲核试剂与醛类化合物的羰基(C=O)反应, 生成稳定腙类衍生物(图2)。相比PFBHA试剂, DNPH在酸性条件下溶解性更好, 尤其在强酸环境中表现优越。基于这一特点, 我们优化了溶液酸度, 采用5%硫酸溶液溶解DNPH, 相较文献(Edwards et al, 2015)中的1%硫酸, 溶解效果显著提升, 可溶解超过95%的DNPH粉末。DNPH的耐酸性使其适用于表征硅藻颗粒吸附态PUAs, 因强酸环境可快速抑制脂氧合酶活性, 避免样品处理中PUAs的诱导合成。
使用液质联用仪进行PUAs定量分析。通过UHPLC实现醛类化合物的基线分离(图2)。相比PFBHA法基于气相色谱(Wu et al, 2016), 分析时间缩短至约5min, 适用于硅藻生长过程中PUAs的高频动态监测。定量分析采用QQQ串联质谱的MRM模式, 通过母体化合物的碎片离子对实现高效、准确的靶向化合物鉴定, 这种多维表征方法提升了代谢组学研究中目标化合物的鉴定效率和准确性。

2.4 颗粒吸附态及相关形态PUAs浓度的动态分析

本研究动态分析了硅藻生长过程中的颗粒吸附态PUAs。鉴于其为硅藻合成并释放的过渡形态, 为更好解析其颗粒物来源及变化规律, 本研究结合了颗粒态PUAs进行对比分析。

2.4.1 颗粒态PUAs浓度动态变化

在三株硅藻中检测并定量颗粒态PUAs, 浓度约为0~45nmol·L-1(图5)。这一结果与Ribalet等(2007)中的骨条藻颗粒态PUAs浓度(约3.2nmol·L-1)及珠江口观测数据(0~41nmol·L-1)(Wu et al, 2016; Wu et al, 2021b)相近。颗粒态PUAs的变化趋势与硅藻叶绿素 a曲线一致(图3), 表明硅藻是其主要生源。
图5 颗粒态和颗粒吸附态PUAs浓度

C7: 庚二烯醛; C8: 辛二烯醛; C10: 葵二烯醛

Fig. 5 Concentrations of particulate PUAs and particle-adsorbed PUAs. C7: heptadienal; C8: octadienal; C10: decadienal

在指数生长期, 颗粒态PUAs浓度较低; 在稳定期, 浓度随叶绿素a峰值显著上升, GY-H22和GY-H23的浓度增加约2倍, GY-H11增幅超过5倍。衰退期时, GY-H11浓度回落至指数期水平, GY-H22则继续增加, 反映了不同生理压力下PUAs合成的差异, 可能与营养盐限制有关(Ribalet et al, 2009)。组成分析显示, 生长期和衰退期颗粒态PUAs以庚二烯醛为主, 占比70%, 稳定期后, GY-H11和GY-H23以辛二烯醛为主, 占比约83.4%(图5a), 与藻华区观测结果一致。葵二烯醛仅在GY-H23中检测到, 占比低于20%(Wu et al, 2021b)。本研究确认庚二烯醛为主要的颗粒态PUAs, 验证了方法的有效性。结果与文献一致, 并在已知物种、藻株及培养条件的变异范围(Wichard et al, 2005)。
本文的颗粒态PUAs含量可能被低估, 原因包括样品制备时未添加pH 7.2缓冲液而使用去离子水, 可能影响PUAs释放; 超声破壁时间仅为2min, 可能未完全释放PUAs。相关研究已探讨并优化了不同样品前处理方法对颗粒态PUAs的影响(Wichard et al, 2005)。

2.4.2 颗粒吸附态PUAs浓度动态变化

通过沉降法和离心法测定三株硅藻颗粒物的体积上下限, 计算得出了颗粒吸附态PUAs的浓度范围(图5b)。结果表明, 三株硅藻的颗粒吸附态PUAs浓度均达微摩尔水平, 范围为0.4~69μmol·L-1, 接近近海藻华区现场观测值(10~90μmol·L-1)(Wu et al, 2021a; Wu et al, 2023)。其中, GY-H11的离心法计算值最高(69μmol·L-1), 比沉降法高出35%; GY-H22最高为3μmol·L-1, 离心法高49%; GY-H23为0.8μmol·L-1, 离心法高12%。
在硅藻生长过程中, 两株中肋骨条藻的颗粒吸附态PUAs变化趋势与颗粒态PUAs相似, 显示颗粒吸附态PUAs是颗粒态PUAs扩散入水柱前的过渡状态。指数期浓度较低, 稳定期显著升高, 尤其是GY-H11。GY-H23则呈现独特的变化, 稳定期浓度下降。颗粒吸附态PUAs的组成变化也明显, 葵二烯醛在稳定期浓度极低。两株中肋骨条藻在指数期以辛二烯醛为主, 庚二烯醛占比低于颗粒态PUAs, 可能因其稳定性和疏水性不如辛二烯醛, 导致其在扩散到细胞外时较易降解。文献证实, 不同碳链长度PUAs的温度稳定性存在差异, 短碳链易降解, 长碳链更稳定(Bartual et al, 2013)。这一现象也在藻华区的现场观测中得到验证, 庚二烯醛在藻华区内较低, 可能与水温和浑浊度有关(Wu et al, 2023)。这些说明, 颗粒吸附态PUAs是非诱导性形态, 是硅藻合成后扩散入水柱前的中间形态, 其稳定性与前体化合物及水文环境密切相关。例如, 低水温可能有利于短碳链庚二烯醛的稳定, 而较高水温则更有利于长碳链辛二烯醛或葵二烯醛的积累。

2.5 硅藻颗粒吸附态氧脂素动态分析在近海藻华监测中的应用

本研究通过系统的实验室过程模拟和定量方法, 适用于中国近海及全球沿岸富营养化硅藻水华区的颗粒吸附态氧脂素监测, 为研究氧脂素在藻际环境中的作用提供了理论和技术支持。这一技术不仅能帮助识别富氧脂素的硅藻水华或赤潮事件, 还能动态跟踪富营养化进程, 为近海生态环境监测提供了实用手段。
全球气候变化加剧了近海富营养化, 常引发富含氧脂素的硅藻水华。水华中后期, 硅藻形成的有机聚合体沉降并释放氧脂素进入藻际环境。藻际微生境中的藻菌互作会在生态系统尺度上影响营养供应与再生、初级生产力、食物网结构与渔获量, 以及与气候相关的碳氧海气通量(Seymour et al, 2017; 张增虎 等, 2018; 王慧 等, 2022)。定量分析氧脂素的变化规律, 可深入地评估其在藻际环境中的积累和转化, 揭示其对近海溶解氧、营养盐循环和微生物群落的调控作用。例如, 珠江口近海藻华以合成PUAs的中肋骨条藻和海链藻为主(Wu et al, 2016; Wu et al, 2021b), 其中水华区颗粒吸附态PUAs浓度高达90μmol·L-1, 对磷限制区藻际细菌的磷降解和再矿化起到关键作用(Wu et al, 2023)。此外, 珠江口近海低氧区颗粒吸附态PUAs浓度约为10μmol·L-1, 加之河口区颗粒附生菌的高丰度(葛在名 等, 2020), 藻源颗粒吸附态PUAs因此能够调控颗粒附生菌群结构和呼吸代谢, 可能加剧水体溶解氧的消耗(Wu et al, 2021a)。

3 结论

本研究优化并发展了一种用于快速定量分析硅藻不同生长条件下颗粒吸附态氧脂素的检测方法。通过沉降和离心两种方式对不同的硅藻颗粒物进行定容, 确定了颗粒物体积的上下限差异在12%~49% 之间, 模拟了海洋藻华环境中硅藻颗粒的沉降和压实过程。优化了5%硫酸溶解的DNPH替代中性缓冲液的PFBHA作为衍生试剂, 避免了新生成PUAs的诱导, 更有利于颗粒吸附态PUAs的制备。通过UHPLC-MS/MS技术, 在约5min实现了PUAs衍生物的快速分离和检测, 建立了适用于硅藻生长过程动态监测的高通量分析方法。该方法应用于三株近海赤潮典型硅藻的室内不同生长阶段监测, 初步定量分析了颗粒吸附态PUAs在硅藻生长过程中的动态演变规律, 结果显示其浓度范围为0.4~69μmol·L-1。中肋骨条藻的两个藻株的颗粒吸附态PUAs变化趋势与颗粒态PUAs较为一致, 但圆海链藻也展现出独特的变化特征。本研究方法为近海富营养化海域硅藻水华(赤潮)环境中氧脂素的时空分布监测提供了重要工具。

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