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Journal of Tropical Oceanography >

2025 , Vol. 44 >Issue 4: 1 - 13

DOI: https://doi.org/10.11978/2024229

Review

Distribution characteristics and microbial metabolic driving mechanisms of N2O in estuarine and coastal waters

  • HONG Yiguo , 1 ,
  • ZHANG Baoshan , 1 ,
  • WU Jiapeng 1 ,
  • LONG Aimin 2, 3
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  • 1. Key Laboratory for Water Quality and Conservation of the Pearl River Delta, Ministry of Education, Institute of Environmental Research at Greater Bay Area, Guangzhou University, Guangzhou 510007, China
  • 2. State Key Laboratory of Tropical Oceanography, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
HONG Yiguo. email:

Received date: 2024-12-07

  Revised date: 2025-01-03

  Online published: 2025-01-07

Supported by

National Natural Science Foundation of China(42276130)

National Natural Science Foundation of China(42476141)

Basic and Applied Basic Research Foundation of Guangdong Province(2023B1515120029)

Science and Technology Planning Project of Guangzhou(2025A03J3103)

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Abstract

Estuarine and coastal waters, serving as critical interfaces between terrestrial and marine ecosystems, play a pivotal role in the biogeochemical cycling of nitrous oxide (N2O), a potent greenhouse gas with significant impacts on global climate change. This review synthesizes current knowledge on the distribution patterns of N2O in estuarine and coastal regions, the key microbial metabolic pathways driving N2O emissions—including nitrification, nitrifier denitrification, incomplete denitrification, and coupled nitrification-denitrification—as well as the methodologies for quantifying N2O production and consumption. Additionally, we examine the environmental factors influencing N2O emissions. A deeper understanding of N2O biogeochemical cycling in these waters is crucial for developing effective strategies to mitigate N2O emissions and their contribution to global warming.

Key words： microbial nitrogen metabolism; N2O; biogeochemical cycle; estuarine and coastal waters

Cite this article

HONG Yiguo , ZHANG Baoshan , WU Jiapeng , LONG Aimin . Distribution characteristics and microbial metabolic driving mechanisms of N2O in estuarine and coastal waters[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2025 , 44(4) : 1 -13 . DOI: 10.11978/2024229

河口近海区域作为连接陆地与海洋的关键纽带, 由于其紧邻陆地, 和人类社会具有天然的紧密联系, 因此人为氮负荷严重威胁河口近海生态系统(Doney, 2010), 容易引起广泛的水体富营养化和生态扰动(Gruber et al, 2008)。随着全球气候变化和人类活动的加剧, 河口近海氧化亚氮(nitrous oxide, N2O)的排放问题日益受到关注, 其分布特征和微生物代谢机制的研究对于理解和预测全球气候变化具有重要意义。河口近海N2O的分布特征受到多种因素的影响, 包括河流输入、海洋环流、生物活动以及人类活动等(Wan et al, 2023)。河口区域由于其独特的地理位置和复杂的物理化学条件, 常常表现出N2O浓度的高变异性(Dai et al, 2008), 而近海区域则受到海洋环流和生物泵作用的影响, N2O的分布和转化过程更为复杂(Tian et al, 2020)。河口近海区域的N2O不仅来源于河流携带的陆地氮输入, 还可能由海洋内部的生物地球化学过程产生, 同时N2O的释放主要与微生物代谢途径密切相关, 其中硝化和反硝化作用是产生N2O的主要途径(Freing et al, 2012)。本文将从河口近海N2O分布特征、N2O释放的主要微生物代谢途径、N2O产生与消耗过程的测定方法以及N2O释放的环境影响因素方面进行综述, 以加深对河口近海N2O生物地球化学循环过程的进一步认识。

1 河口近海N2O的分布特征

N2O是一种仅次于二氧化碳(carbon dioxide, CO2)和甲烷(methane, CH4)的重要温室气体, 是一种长寿命温室气体, 在大气中的生命周期约为114~120年(Solomon et al, 2007)。在大气中, N2O的浓度比CO2低得多, 但在百年尺度上, 其单分子的增温潜势力却大约是CO2的300倍, 是一种具有强辐射效应的痕量气体, 占据每年全球变暖效应的6%~10%(Montzka et al, 2011)。此外, 在太阳辐射下, N2O可以在平流层中进行光解离作用形成NO自由基, 进而参与臭氧(O3)分解的链式反应, 导致了大气臭氧层的消耗(Crutzen, 1970), 因此N2O也将成为21世纪破坏臭氧层的重要物质(Ravishankara et al, 2009), 可见N2O对调控全球气候变化起着关键性作用, 深刻影响着人类生存。自1750年以来, 由于人类活动的影响, 大气中N2O的浓度增加了约20%(Hartmann et al, 2013), 同时大气N2O浓度仍以每年0.25%~0.31%的速度快速增长, 目前已达到331nmol·mol−1(干燥空气摩尔分数)(Tian et al, 2020; Qin et al, 2024)。因此, 关于N2O排放的相关研究课题以及科学前沿问题一直受到国内外科学家高度关注。
海洋是大气N2O的重要来源, 据Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC)2013报道, 每年海洋的N2O排放量约为3.8Tg N, 而河口近岸海域N2O的排放量每年约为0.6Tg N, 然而该值低估了海洋对全球N2O释放的贡献(IPCC, 2013)。Nevison 等(1995)通过对60286个表层海水样品N2O的含量进行分析, 估算出全球海洋表层水体表观N2O(ΔpN2O)约为103.5%, 每年海洋N2O排放量约为4(1.2~6.8)Tg N, 其中主要N2O排放源为北太平洋、赤道上升流以及热带沿海上升流海域; 而Codispoti估算海洋每年N2O排放约为1.4×1011mol(6Tg N), 其中大约一半的N2O排放发生在开阔大洋缺氧的水体中(Codispoti, 2010)。在开阔大洋, N2O的释放源主要集中在含氧最小层海域(oxygen minimum zone, OMZ)(Nevison et al, 1995)。在OMZ海域, N2O的垂直分布都与溶解氧(dissolved oxygen, DO)浓度有较好镜像关系, 而且与 NO 3 −呈正相关关系, 并在OMZ上下边界都存在峰值, 呈双峰结构, 而在OMZ内N2O的浓度较低(Cohen et al, 1979; Bange et al, 2001), 该结果为推测硝化或者硝化耦合反硝化作用是最主要海洋N2O的产生过程提供了客观的依据。然而, Babbin 等(2015)在东部热带北太平洋(the eastern tropical North Pacific, ETNP)的OMZ区域研究发现, OMZ区域N2O的转化速率比现有模型预测高出一个数量级的现象是由于不完全反硝化(incomplete denitrification, iDNF)在OMZ上层水体(有氧—无氧界面)发挥作用, 表明iDNF是OMZ区域N2O释放的主要来源之一, 而随着低氧海水的不断扩张, 由iDNF介导的快速N2O循环速率将进一步提高海洋N2O的排放量。在沿海海域中, 上升流海域也是海洋N2O释放的重要来源, 上升流海域N2O的释放量可约占海洋排放量的5%(Nevison et al, 2004)。同时研究发现热带南太平洋秘鲁上升流海域N2O排放量对全球海洋N2O排放的贡献比之前已知的要高, N2O排放量为0.2~0.9Tg N·a-1, 约占海洋排放量的5%~22%(Arévalo-Martínez et al, 2015), 该类海域有显著高的N2O释放通量, 主要是水体上升流作用将下层微生物介导产生的高N2O输送到表层水体, 从而导致表层水体N2O的过饱和现象。
近几十年来, 由于人类活动的严重干扰, 河口生态系统氮元素负荷严重超载(Howarth et al, 2008), 过量的活性氮被微生物和生产者利用并产生各种产物, 包括N2O气体(Vitousek et al, 1997; Wrage et al, 2001)。在海洋N2O排放量中, 每年约有0.7×1011mol(3Tg N)N2O的排放发生在河口生态系统(Codispoti, 2010), 而河口近海海域N2O释放约占海洋N2O排放的15%~45%, 对应占据全球N2O排放量约25%~33% (Bange et al, 1996; Seitzinger et al, 1998; Naqvi et al, 2010)。由于受到人类活动干扰, 河口低氧现象不断加剧, 近海N2O的释放显著提高(图1)(Codispoti, 2010), 在近岸低氧海域的观测中发现, 高N2O释放通量与DO水平呈显著负相关关系(Rosamond et al, 2012; Lin et al, 2016; Carrasco et al, 2017; Hu et al, 2023)。然而, 较少有研究考察低氧河口沉积物N2O的具体释放机制, 由于复杂多变的河口环境、测量方法间差异以及河口多种N2O产生主要途径耦合关系, 河口近海环境的N2O分布及其释放机制尚需进一步评估和研究。
图1 近海N2O释放概念图(数据来源 https://odv.awi.de/data/ocean/world-ocean-atlas-2023/)

Fig. 1 Conceptual diagram of N2O release in coastal waters (data source: https://odv.awi.de/data/ocean/world-ocean-atlas-2023/)

2 N2O释放的主要微生物代谢途径

从基础化学角度来看, N2O是活性氮(铵盐 NH 4 +、硝酸盐 NO 3 −和亚硝酸盐 NO 2 −)转化过程的中间反应产物, N2O的产生可由微生物或非微生物因素介导(Quick et al, 2019)。N2O产生与消耗过程主要受到微生物的强烈调控, 因此, 从微生物介导的角度来研究N2O产生过程是非常重要的。根据N2O产生反应条件以及介导的微生物不同, 可主要分为硝化作用(nitrification, NN)、不完全反硝化作用(iDNF)、硝化细菌反硝化作用(nitrifier denitrification)、硝化作用耦合反硝化作用(nitrification coupled denitrification, NCD), 如图2所示。细菌硝化和反硝化作用被认为是海洋N2O的主要来源, 由N2O还原酶介导的N2O的还原过程是目前已知微生物消耗N2O的唯一途径。本论文主要探讨不完全反硝化过程中N2O的释放问题, 因此反硝化过程与N2O还原过程将作重点介绍。
图2 多条相互联系且与N2O产生和消耗相关的氮循环途径

Fig. 2 Multiple interrelated nitrogen cycling pathways involved in both N2O production and consumption

2.1 硝化过程

硝化过程(nitrification, NN)是海洋N2O产生的重要过程。在该过程中, N2O可以通过中间反应产物(NH2OH和 NO 2 −)的副反应途径产生, 分别为羟胺氧化(hydroxylamine oxidation)和化学反硝化两个途径, 如图3所示。
图3 硝化过程

amoA: 氨单加氧酶(ammonia monooxygenase, AMO)基因; hao: 羟胺氧化还原酶(hydroxylamine oxidoreductase)基因; nxrA/B: 亚硝酸盐氧化还原酶(nitrite oxidoreductase, nxrA, nxrB)基因

Fig. 3 Nitrification

其中, 羟胺氧化生成N2O途径可通过生物和非生物过程完成。生物催化羟胺氧化过程由氨氧化微生物(ammonia oxidizing bacteria, AOB或ammonia oxidizing archaea, AOA)中羟胺氧化酶(hydroxylamine oxidase, HAO)催化完成。对于AOB来说, N2O的产生一般被认为是由其介导的不完全NH2OH氧化反应引起的, 其中产生的副产物NO进一步被一氧化氮还原酶还原成N2O(Stein, 2011; Zhou et al, 2023)。同时研究发现在好氧和厌氧条件下, HAO只通过3个电子将NH2OH氧化成NO, 表明了AOB可以通过两个专性的中间体(NH2OH和NO)进行NH3氧化, 这为研究AOB如何介导NH3氧化过程产生N2O等工作提供了补充和新的思路(Caranto et al, 2017)。相较于AOB, AOA介导的N2O产生过程的机制研究较少且尚未清晰, 需进一步深入研究。Santoro等(2011)基于富集培养基础以及同位素分析手段, 首次报道了AOA也能产生N2O的证据, 表明AOA介导的微生物过程可能是海洋N2O的主要来源。此外, AOA也可通过释放关键中间体NO, 进而进行化学羟胺氧化(非生物因素)产生N2O(Kozlowski et al, 2016)。同时利用抑制剂对AOB进行抑制的土壤研究中发现AOA主导了氨氧化过程, 并伴随着少量N2O的产生(Hink et al, 2017), 并在完全氨氧化(complete ammonia oxidization, comammox)的Nitrospira inopinata研究中发现, Nitrospira inopinata介导形成的N2O来源于羟胺的非生物转化(Kits et al, 2019)。

2.2 硝化细菌反硝化过程

硝化细菌反硝化过程(nitrifier denitrification, ND)是一个涉及氧化与还原的过程。在ND中, 首先微生物将氨氧化成亚硝酸盐, 然后亚硝酸盐依次还原为NO、N2O和N2(Wrage et al, 2001; Sun et al, 2024), 如图4所示。
图4 硝化细菌反硝化过程

nirK: 含铜的亚硝酸盐还原酶(copper nitrite reductase, Cu-NIR)基因; nirS: 细胞色素型亚硝酸盐还原酶(cd1-NIR); nosZ: 氧化亚氮还原酶(nitrous oxide reductase, NOS)基因

Fig. 4 Nitrifier denitrification

该过程往往容易跟硝化过程、硝化过程耦合反硝化过程混淆, 但我们可以根据底物来源以及介导的微生物不同而区分开。其中, 硝化细菌反硝化过程是只由氨氧化微生物介导和 NH 4 +作为反应底物来源, 且没有 NO 3 −产生(Wrage et al, 2001)。该过程在土壤中研究较多, 是土壤N2O释放的一个重要驱动力(Wrage et al, 2001; Kool et al, 2009; Zhu et al, 2013a; Shi et al, 2017; Bore et al, 2024)。例如, Kool 等(2009)利用氮氧同位素标记法在含水率高的土壤中测出ND过程的贡献率可达50%~100%; 在添加尿素或(NH4)2SO4以及不同氧气浓度调控的土壤研究中, 在氧气浓度为0.5%时, ND的贡献可达39%~56.1%(Zhu et al, 2013a), 该研究也同时证明低氧条件有利于ND的发生。目前研究发现ND过程主要由AOB介导完成, 如Nitrosomonas europaea(Kozlowski et al, 2014; Liu et al, 2024)和Nitrosospira(Shaw et al, 2006), 然而关于海洋ND过程研究较少。在海洋AOB介导产生的N2O同位素特征的研究中, 低的δ15N值可推测出N2O可能是通过ND过程产生, 而且在0.5%的溶氧环境下, ND的贡献可达87%(Frame et al, 2010)。目前, 河口系统中ND过程还没有得到进一步的系统研究, 并且随着人类活动的干扰以及河口低氧水体的扩大, ND过程对河口N2O的贡献不可小觑, 关于ND过程的机制需要进一步研究。

2.3 不完全反硝化过程

异养反硝化过程(heterotrophic denitrification, HD)对各种生态系统氮的生物地球化学循环具有重要意义, 因为该过程能将各系统中的氮素(NO 3 −形式)最终转化为N2的形式返回到大气中(Kuypers et al, 2018)。特别是在接收过量的 NO 3 −输入河口—近海系统中时, 反硝化过程在脱氮过程中发挥了巨大的作用(Ward et al, 2009)。反硝化过程是指在厌氧或者缺氧的条件下, 反硝化微生物将可溶性的氮氧化合物(NO 3 −和 NO 2 −)还原生成气态的NO、N2O和N2(Zumft, 1997), 如图5所示。
图5 反硝化过程、不完全反硝化过程和N2O还原过程

Fig. 5 Processes of denitrification, incomplete denitrification, and N2O reduction

HD有明显的模块化特征, 通过4个反应步骤将 NO 3 −还原成N2。首先是硝酸盐异化还原成亚硝酸盐过程(NO 3 −→ NO 2 −), 该步骤由napA或者是narG基因编码的细胞周质硝酸盐还原酶(periplasmic nitrate reductase, NAP)或者与膜结合的硝酸盐还原酶(respiratory nitrate reductase, NAR)催化完成, 并且大多数微生物都含有NAP和NAR(Moreno-Vivián et al, 1999; Han et al, 2024), 同时产生的 NO 2 −可供给下一步反应或者其他氮循环, 如厌氧氨氧化反应。第二步骤是亚硝酸盐还原生成一氧化氮过程(NO 2 −→NO), 其是用来定义反应是否为反硝化过程的步骤, 该过程可分别由两类亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase, NIR)催化完成, 细胞色素型亚硝酸盐还原酶(cd1-NIR)和含铜的亚硝酸盐还原酶, 分别由nirS和nirK基因编码合成, 虽然两类NIR都处于周质, 但它们的结构和催化位点不同。然后是一氧化氮生成氧化亚氮过程(NO→N2O), 由一氧化氮还原酶(nitric oxide reductase, NOR)催化完成, 该步骤存在于很多微生物中, 因为NO对于大多数微生物来说是一个高毒性的物质, 因此很多微生物都有NOR催化NO转化的功能。由于NOR的多样性, 所以不同微生物中编码NOR的相关基因存在差异, 如cnorB、qnorB、norYS和P450nor基因。最后一步是氧化亚氮生成氮气过程(N2O→N2), 由氧化亚氮还原酶(nitrous oxide reductase, NOS)催化完成, 目前编码NOS的nosZ基因有nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ基因(Sanford et al, 2012; Jones et al, 2013)。
然而, 若上述最后一步反硝化进程(N2O→N2)未完成, 那么中间产物N2O可能成为最终产物, 从而形成iDNF(图5), 进而导致反硝化过程中较高的N2O/(N2 + N2O)产物比例, 而iDNF的发生意味着比起完全反硝化过程, 将会有更多的N2O进入到大气中(Babbin et al, 2015)。由于反硝化在多种自然生态系统中都具有较高的活性, 因此iDNF可能是全球主要的N2O生成途径(Quick et al, 2019)。我们可从微生物自身以及环境条件影响这两个角度阐述iDNF的发生以及重要性。从微生物角度, 很多反硝化细菌拥有所有反硝化还原酶以便执行完整的反硝化过程, 但也有一些微生物缺乏nosZ基因, 导致N2O是脱氮的最终产物, 如Agrobacterium tumefaciens C58(Philippot et al, 2011)和Pseudomonas aureofaciens(Granger et al, 2006)。从环境条件影响的角度, 如何平衡N2O的产生与消耗, 即NOS与NIR发挥活性的相对大小是研究iDNF对N2O释放贡献多少的关键问题。在反硝化过程中, 对比其他反硝化还原酶, NOS对氧的抑制作用更为敏感(Zumft, 1997), 因此, 在低氧条件下NOS活性受到抑制作用比NIR更强, 致使N2O更多以终产物的形式释放到环境中, 从而导致了N2O的释放, 也就是发生了iDNF过程。在ETNP以及南太平洋东部近岸低氧水体的研究中, 高N2O与低氧的呈现明显存在正相关关系, 表明低氧水体中iDNF对N2O的释放发挥了关键作用(Babbin et al, 2015; Carrasco et al, 2017)。
尽管N2O的产生有多种来源, 然而由NOS催化N2O还原成N2的过程是目前唯一已知的N2O消耗途径。N2O作为反硝化中间产物以及其他过程(ND等)的产物, 其是一种游离性物质(Zumft, 1997), 可以被含NOS的微生物还原成N2, 包括完全反硝化细菌以及只含NOS的微生物(Zumft et al, 2006; Domeignoz-Horta et al, 2016), 后者可在N2O作为唯一的电子受体下生长。因此, 研究介导N2O还原过程的微生物(N2O还原微生物), 对进一步认识N2O还原微生物作为唯一的N2O汇以及N2O产生与消耗的平衡关系有着重要意义(Hu et al, 2015; Yeerken et al, 2024)。研究发现NOS具有两个不同的系统进化分枝, 分别为clade I和clade Ⅱ(Sanford et al, 2012; Jones et al, 2013), 对应编码的基因为nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ。nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ编码的N2O还原酶具有不同的跨膜机制, 它们用于跨膜的信号肽不同, nosZ Ⅰ簇为Tat信号肽, 而nosZ Ⅱ簇为Sec信号肽(除Ferroglobus placidus、Thermomicrobium roseum和Sphaerobacter thermophilum)。nosZ Ⅱ簇的微生物多样性比nosZ I簇的高, 除了包括nosZ I簇所属的α-、β-、γ-Proteobacteria以及古菌, nosZ Ⅱ簇还包括有Bacteroidetes、Firmicutes和δ-、ε-Proteobacteria(Jones et al, 2013), 此外, nosZ Ⅱ 簇的N2O还原微生物包括了很大比例的非完全反硝化微生物(non-denitrifiers)。在对涵盖18个门的652个微生物基因组的分析中, Graf 等(2014)发现反硝化基因nirS、nirK和nosZ(Ⅰ和Ⅱ)的共存模式在不同类群中不是随机的, 而是确实存在不同的模式。例如, 部分含nirK生物(35%)缺乏典型的nor基因, 而大多数(70%)没有nosZ; 相比之下, 只有3.6%的nirS型反硝化菌缺乏nor, 20%的没有nosZ基因; 而在所有含有nosZ的生物中, 30%的微生物不具有任何nir基因, 约24%的微生物不具有nor基因, 其中52%含nosZ Ⅱ基因的基因组缺乏nir基因, 而含有nosZ I的基因组中只有16%缺乏nir。另外, 在很多环境中发现的含nosZ Ⅱ基因的非反硝化细菌归类于Anaeromyxobacter、Dyadobacter、Gemmatimonas、Ignavibacterium、Melioribacter和Pedobacter, 表明了以往只针对nosZ I簇的研究低估了介导N2O还原过程的微生物群落的丰度和多样性(Jones et al, 2013; Hallin et al, 2018)。随后, 通过控制N2O还原微生物的丰度得到47种不同类型土壤N2O的sink capacity指数, 与nosZ Ⅱ/nosZ Ⅰ丰度比值进行相关性分析, 结果表明两者呈正相关关系(Jones et al, 2014), 并且在白洋淀河岸带, 研究人员发现nosZ Ⅰ/nosZ Ⅱ的比例会影响N2O的产生速率(Zhao et al, 2018)。这些研究表明了含nosZ Ⅱ基因的微生物(包括与N2O产生无关的非反硝化微生物)对N2O还原有重要潜在贡献。此外, 在N2O浓度低的条件下, nosZ Ⅱ簇比nosZ I簇微生物更具有优势地位(Yoon et al, 2016; 李冀 等, 2017)。因此, 通过了解介导N2O还原过程的微生物群落组成的变化, 特别是与反硝化功能微生物之间的比例变化, 将对微生物介导的N2O释放机制有进一步的认识。
在反硝化功能基因中, nirK/S、nosZ基因相较于其他功能基因(napA, narG和cnorB)常用于作为研究介导反硝化过程N2O产生和消耗过程的微生物群落的分子标记。同时在一些土壤和湖泊的研究中发现nirK/S、nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ基因丰度与N2O释放有一定的相关关系(Saarenheimo et al, 2015; Zhao et al, 2018), 并且在环境微生物的研究中nirS和nirK基因更是常作为分子标记物用于研究反硝化菌群的群落结构变化。虽然nirS和nirK编码的还原酶具有相同的功能(将亚硝酸盐转换成一氧化氮), 但是除Rhodothermus marinus外, 目前还未发现能同时编码NirS和NirK的其他基因组(Graf et al, 2014)。对于生态功能等效的NirS和NirK, 是否存在生态位差异和不同进化关系目前仍存在争议(Jones et al, 2010), 但是多数研究表明nirS与nirK基因功能微生物存在生态位差异。在土壤系统中, nirS与nirK型反硝化细菌都较为活跃。在水稻土中, nirK型的反硝化细菌比nirS型的反硝化细菌对反硝化诱导条件更敏感(Yoshida et al, 2010); 在高pH土壤中, nirS丰度与反硝化活性的相关性更高, 而在低pH土壤中, nirK丰度与反硝化活性的相关性更高(Bowen et al, 2020)。然而, 在大多数河口研究中, nirS基因占据主导地位, 在昆士兰的亚热带河口研究发现NIR主要以NirS为主(Abell et al, 2010; Cheng et al, 2023)。同样, 旧金山湾河口的研究表明nirS基因丰度与多样性比nirK高, 且反硝化活性主要由nirS型反硝化细菌主导(Mosier et al, 2010; Lee et al, 2017)。因此, 在河口生态系统的研究中, nirS基因相较于nirK基因更适合作为分子标记来研究反硝化细菌的群落结构及其与反硝化活性的关系。
反硝化微生物具有呼吸代谢多样性。除了在厌氧的条件下, 反硝化微生物以 NO 3 −/ NO 2 −作为电子受体进行呼吸作用, 还可以在有氧的条件下, 以 NO 3 −和O2作为电子最终受体进行好氧反硝化过程(Robertson et al, 1984)。好氧反硝化过程大多发现在废水处理过程中(Ji et al, 2015a), 但在河口区湿地生态系统中也分离到好氧反硝化微生物(Fu et al, 2019; 陈玲 等, 2016)。通过对好氧反硝化微生物Paracoccus denitrificans和K50菌株的研究中, Takaya 等(2003)发现好氧反硝化过程中可产生少量的N2O。此外, 最近研究发现沿海沉积物中N2O的释放并非由于细菌反硝化活性贡献, 而是由真菌反硝化以及化学反硝化过程所主导(Wankel et al, 2017)。真菌反硝化系统主要包括了含铜亚硝酸盐还原酶(NirK)以及细胞色素P450一氧化氮还原酶(Shoun et al, 1991), 而真菌反硝化系统中缺乏N2O还原酶, N2O是真菌反硝化过程的最终产物, 所以在一定条件下, 真菌反硝化可能成为N2O排放的主要来源。然而, 目前对河口—海岸真菌反硝化产N2O的贡献与机制尚未清晰, 需进一步研究。

2.4 硝化作用耦合反硝化过程

硝化作用耦合反硝化过程(nitrification coupled denitrification, NCD)是一个包含氧化和还原反应产生N2O的过程, 如图6所示。
图6 硝化作用耦合反硝化过程

Fig. 6 Nitrification coupled denitrification

NCD区别于NN和iDNF过程在于N2O的N来源以及介导的微生物不同: NCD过程产生N2O的氮来源于硝化过程的底物 NH 4 +, 介导NCD的微生物包括硝化微生物与反硝化微生物。在土壤研究中, NCD过程产生N2O的相对贡献(在NN、ND、NCD和HD中)可达34%(Kool et al, 2010); 在海洋生态系统中, NCD是N2O释放的重要途径之一。总体上, NCD的发生主要由于环境中溶氧跃层的出现, 而在溶氧跃层上界面的好氧层, 微生物可以通过硝化作用将 NH 4 +氧化生成 NO 3 −, 继而生成的 NO 3 −输入到下界面的缺氧层或者厌氧层, 并通过反硝化作用产生N2O, 如OMZ上层水体以及颗粒表面微氧环境(Arévalo-Martínez et al, 2015; Bianchi et al, 2018)。

3 N2O产生与消耗过程的测定方法

N2O作为众多反应(NN、ND、NCD和iDNF等)的终产物以及硝化细菌反硝化过程(ND)的中间产物, 辨析其具体产生过程和消耗过程对加深理解多种生态系统N2O的来源与释放有重要意义, 但同时也面临着辨析方法限制的巨大挑战。目前, 关于N2O的产生与消耗过程的测定手段主要包括乙炔抑制法、同位素自然丰度法以及稳定同位素示踪法。
早期, 乙炔抑制法用于区分土壤硝化以及反硝化作用对N2O释放的相对贡献(Khalil et al, 2004)。乙炔(C2H2)作为一种常用抑制剂, 它可以转化为一种非常活泼的不饱和环氧化物, 然后共价结合AMO, 抑制氨氧化过程从而抑制硝化过程的发生(Wrage et al, 2001)。Hynes 等(1978)发现在C2H2分压大于1Pa时, 氨氧化微生物Nitrosomonas europaeu的活性将完全受到抑制。研究表明, 在0.1~10Pa低分压C2H2条件下, 氨氧化过程开始与完全受抑制; 而在大于10kPa, 反硝化过程N2O的还原将受到抑制(Berg et al, 1982)。因此, 通过气相色谱测定各个实验组以及控制组的N2O浓度, 可区分硝化过程与反硝化过程(包括了ND和HD)N2O的产生速率。乙炔抑制法在反硝化过程N2O释放研究中也得到进一步改进与广泛应用, 即在厌氧条件下通过添加乙炔和不添加乙炔组N2O产生量的结果, 从而得出反硝化过程N2O产生速率以及潜在反硝化速率(Domeignoz-Horta et al, 2015; Zhao et al, 2018)。然而, 随着多个N2O产生途径的发现, 乙炔抑制法已经不能满足我们进一步理解多个N2O产生过程各自贡献的要求。同时, 乙炔抑制法也存在某些缺陷: 如乙炔分解、扩散不完全导致的抑制效果不完全, 底物依赖性以及可被用于进行碳源代谢, 从而影响微生物的活性等(Butterbach-Bahl et al, 2013)。
同位素自然丰度法也被用于推测N2O的产生与消耗过程。产生和消耗N2O的微生物过程基本倾向于利用轻的同位素, 使得残余化合物相对具有较高的δ15N和δ18O, 即发生同位素分馏。由于各个反应过程所处的环境以及反应机制的不同, 不同途径生成的N2O具有同位素信号的差异。因此, 对照各个过程纯培养微生物获得的15N和18O分馏值, 可以推测出N2O产生与消耗的途径, 但难以区分各自的贡献(Baggs et al, 2010)。目前, 基于自然丰度法以及N2O同位素异构体15N位点优势值(site preference, SP)特征分析对N2O进行溯源的研究得到广泛关注。溯源依据是不同的微生物过程作用产生的N2O, 其中间位(α位)和末端位(β位)原子的δ15N的差值SP(SP=δ15Nα−δ15Nβ)存在一定的差异。Wong 等(2021)通过自然丰度法以及N2O的SP值特征分析, 揭示了硝化细菌反硝化作用是河口浅含水层N2O产生的主要途径。
稳定同位素示踪法是通过添加15N或(和)18O同位素标记物对N2O产生和还原过程进行示踪, 定量单个过程N2O释放情况或者多个反应过程贡献的方法。基于该方法, 我们可以对不同N2O产生途径进行量化, 这对深入探究N2O释放具体机制具有重要意义。在贝德福德海岸海湾的研究中, Punshon和Moore利用15 NH 4 +、15 NO 3 −和(15N)2O标记物, 同时测定了水体氨氧化过程N2O产生速率、反硝化过程N2O产生速率和N2O消耗速率(Punshon et al, 2004)。Li 等(2017)通过添加15 NH 4 +、15 NO 3 −以及C2H2组合实验, 甄别了生物反应器中自养硝化、异养硝化和异养反硝化过程对N2O产生的贡献。利用15 NH 4 +、15 NO 3 −和15 NO 2 −标记实验, Ji 等(2015b)量化了热带南太平洋东部(Eastern Tropical South Pacific, ETSP)的OMZ上层水体以及中心水体的硝化过程、反硝化过程(NO 2 −还原与 NO 3 −还原)中的N2O产生潜力, 并发现上层水体N2O是由硝化作用和反硝化作用共同主导产生的, 而反硝化作用是OMZ中心唯一的N2O来源, 该研究表明反硝化作用主导了ETSP-OMZ的N2O释放。相似的结果出现在ETNP-OMZ, Babbin 等(2015)利用(15N)2O示踪N2O还原过程, 发现了低氧区高N2O循环速率, 揭示了低氧水体中不完全反硝化过程对N2O产生的重要贡献。考虑到只通过15N标记以及抑制法难以将NN和ND过程区分开, Wrage 等(2005)提出了氮氧双同位素示踪方法(dual-isotope labelling)用于更好地区分这两个过程, 并首次提供了ND过程在耕地土壤N2O的排放中占据重要贡献的直接证据, 该技术的理论依据是基于NN和ND过程产生的N2O中氧原子来源不同。Kool 等(2009)进一步完善该方法, 提出氧交换效率, 并用于区分多个N2O产生过程。具体来说, NN过程产生的N2O(N2ONN)氧原子全部来源于O2; N2OND氧原子则一半来源于O2, 一半来源于H2O; N2OHD氧原子则全部来源于 NO 3 −; 而N2ONCD氧原子1/3来源于O2, 2/3来源于H2O, 因此, 通过15N标记物以及18O-H2O的配合使用, 可将NN、ND、NCD和HD过程区分开。该方法较多应用在土壤研究中, 例如Zhu 等(2013b)基于该方法, 量化了不同低氧条件下不同N2O产生过程的贡献, 提供了低氧条件下NN和ND是N2O释放主要过程的直接证据。此外, 由于反硝化过程的15N标记实验中15N2O和15N2的产生几乎是同时的, 因此应用同时测定15N2O和15N2的方法将进一步提高反硝化过程N2O释放量测定的准确性(Hsu et al, 2013)。

4 N2O释放的环境影响因素

河口近海海域的环境多变, 生物地球化学循环活跃, 其N2O排放的环境驱动因素更为复杂。总体上, 影响N2O排放的主要环境驱动因子包括溶解氧水平、有机碳浓度、溶解态无机氮盐(dissolved inorganic nitrogen, DIN)浓度、温度、盐度、深度和季节变化等(Murray et al, 2015; 洪义国 等, 2020)。实质上, 这些因素影响N2O的排放主要是通过影响微生物介导的多种N2O产生与消耗途径(Wrage et al, 2001)。
溶解氧水平决定了该环境是氧化还是还原状态, 影响着该环境NN、ND和iDNF等多个过程N2O的释放。由于不同河口存在较大环境差异, 不同河口的N2O主导调控机制存在差异(Dong et al, 2006)。一般来说, 在水体和沉积物中, 缺氧条件有利于反硝化过程释放N2O, 而高浓度氧有利于硝化或硝化细菌反硝化过程(Barnes et al, 1999; Ji et al, 2015a; Wang et al, 2024)。低氧以及高 NO x −环境可以促进反硝化活性, 从而导致N2O产量增加(Barnes et al, 1999; Chen et al, 2011)。而在一些溶氧适中和高 NH 4 +的环境中, 硝化作用或者是硝化耦合反硝化作用是河口N2O释放的主要过程(Muñoz-Hincapié et al, 2002)。有趣的是, Löscher 等(2012)在东热带北大西洋(ETNA)的研究中发现, AOA-amoA基因的丰度和表达量的最大值与N2O最大值和DO最小值有相关关系, 而AOB-amoA基因并未发现显著相关关系; 继而在纯培养AOA Nitrosopumilus maritimus SCM1的研究中发现, 低氧浓度下, N. maritimus具有高N2O产量, 而且与ETNA氧跃层中N2O的气体量接近。这些研究结果表明了在低氧条件下, AOA可能在海洋硝化过程释放N2O中发挥重要作用(Santoro et al, 2011; Löscher et al, 2012)。另外, 在低氧条件下不完全反硝化过程是海洋OMZ区域N2O释放的重要过程(Babbin et al, 2015), 同时低氧且具有一定反硝化速率的复杂河口区, 也是N2O释放的热点区域(Codispoti, 2010)。有研究表明, 在一些好氧—厌氧界面(OMZ上层), 往往硝化作用耦合反硝化过程比传统异养反硝化更占主导地位(Arévalo-Martínez et al, 2015), 这可能是上层水体输入的营养盐(特别是 NH 4 +)较多, 导致来自上层好氧硝化过程的硝酸盐在厌氧层的总硝酸盐中占优势。Zhu等(2013b)通过土壤培养实验, 发现在不同氧浓度下, NN、ND、NCD和HD对N2O释放贡献的不同, 这表明了氧气是影响各过程发挥活性的重要因素之一。对于沉积物而言, 由于氧在沉积物中的扩散往往被限制在几毫米的深度, 因此, 硝化作过程可能发生在氧还未消耗的空间, 但总体上沉积物N2O的释放主要是由反硝化作用所主导(Murray et al, 2015)。
有机碳浓度、DIN浓度、温度和盐度也是影响N2O排放的重要因素之一。因为大多数的反硝化微生物是异养微生物, 因此有机碳可利用性的增加, 可能促进了反硝化过程以及提高了N2O产生潜力(Wrage et al, 2001; Kan et al, 2024)。然而, 河流潜流带的研究中发现, 降低有机碳和提高硝酸盐会促进N2O的产生(Quick et al, 2016; 丁吾举 等, 2024)。DIN的浓度是影响N2O释放的重要因素之一, 高浓度 NO 3 −和 NO 2 −会促进反硝化过程, 从而促进N2O的产生, 特别在沉积物中(Adams et al, 2012); 而高浓度 NH 4 +会促进硝化过程产生N2O, 沉积物和水体均可发生(Muñoz-Hincapié et al, 2002; Barnes et al, 2011), 总体上在河口环境中, 硝化作用比反硝化作用产生的N2O总量低(Murray et al, 2015)。最近, Tan 等(2020)基于实验室温度调控实验, 揭示了升温直接刺激了反硝化作用产生的N2O, 且在全球变暖影响下, 升温可能会抑制厌氧氨氧化活性, 并导致更多的氮流向反硝化作用, 促使相关的N2O产生。盐度作为河口变化最显著的环境参数之一, 也是影响N2O排放的重要因素。在河口沉积物中, N2O产生量基本从上游到下游随着盐度的升高而急剧下降, 且在高盐度地区N2O产生量极少(Teixeira et al, 2013), 同样在水体中N2O的浓度随盐度增加而降低(Xie et al, 2024)。

5 未来研究展望

随着全球气候变化和人类活动的加剧, 河口近海区域作为陆地与海洋生态系统的交汇点, 其环境状况日益受到关注。特别是在氮循环过程中, N2O作为一种重要的温室气体, 其在河口近海区域的排放对全球气候变化具有显著影响。N2O的产生和消耗不仅与环境因素紧密相关, 而且受到微生物代谢活动的强烈影响。虽然当前对于河口近海区域N2O分布特征及其微生物代谢驱动机制已有诸多研究, 但是仍然存在诸多需要解决和完善的问题, 未来的研究可以从以下几个方向进行深入探讨。
1)开发N2O还原菌的富集培养方法。虽然大家意识到纯菌富集培养的重要性, 但是N2O还原菌尤其是只含有nosZ基因N2O还原菌的富集培养及分离较困难, 导致很多科学家望而却步, 其富集培养影响因素及条件优化是科学家研究的一个重要方向。
2)阐明N2O产生与消耗过程中的微生物代谢机制。采用高通量测序技术(宏基因组、宏转录组、微生物单细胞基因组、代谢组学等)进行多组学联合分析, 探讨N2O产生与消耗过程中涉及微生物的物种分类、系统发育和代谢功能等。
3)解析河口近海区域的生态位分布。河口近海区域的微生物群落组成及氮循环过程复杂多变, 只有明确其生态位差异才能全面理解河口近海N2O的生物地球化学循环, 为减少N2O排放和保护全球气候提供科学依据。

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