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Journal of Tropical Oceanography >

2025 , Vol. 44 >Issue 6: 176 - 187

DOI: https://doi.org/10.11978/2025011

Exploitation of Marine Resources

Virtual screening of potential anti-osteoarthritic peptides from sea cucumber and their mechanisms based on network pharmacology, molecular docking, and quantum chemistry calculation*

  • DUAN Ailing , 1, 2 ,
  • LI Si 1, 2 ,
  • ZHAO Xiangtan 1, 2 ,
  • CHEN Hua , 2 ,
  • WAN Peng 2 ,
  • CHEN Deke 2 ,
  • CAI Bingna 2 ,
  • PAN Jianyu , 2
Expand
  • 1 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
  • 2 State Key Laboratory of Tropical Oceanography/Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
PAN Jianyu, email: ;
CHEN Hua, email:

Received date: 2025-01-15

  Revised date: 2025-03-26

  Online published: 2025-04-01

Supported by

Marine Economic Development Project of Guangdong(GDNRC[2024]49)

Fold

Abstract

Osteoarthritis (OA) is a chronic degenerative joint disease characterized by the progressive loss of articular cartilage and the destruction of joint structures. This study investigates the potential role of sea cucumber peptides in combating OA. Potential bioactive peptides from sea cucumber protein were identified through computer simulations of gastrointestinal digestion and online database predictions. Using network pharmacology, molecular docking, and quantum chemical calculations, a sea cucumber peptide candidate (phenylalanine-aspartic acid-proline-valine-isoleucine-glutamic acid-glutamic acid-tyrosine-histidine-asparagine-glycine-phenylalanine, FDPVIEEYHNGF) with strong anti-OA activity was virtually screened. Further analysis suggests that this peptide may alleviate OA by modulating the IL-17 and TNF signaling pathways, inhibiting inflammation, collagen degradation, and the activity of matrix metalloproteinases (MMPs). The sea cucumber peptide may form hydrogen bonds with MMP9 and IL-17RA, potential core targets for OA, thereby influencing the related signaling pathways, reducing inflammation, intervening in extracellular matrix remodeling, and mitigating collagen degradation. This study provides new insights into the application of sea cucumber peptides as functional food ingredients in the development of therapeutic foods for OA.

Key words： sea cucumber peptides; osteoarthritis; network pharmacology; molecular docking; quantum chemistry

Cite this article

DUAN Ailing , LI Si , ZHAO Xiangtan , CHEN Hua , WAN Peng , CHEN Deke , CAI Bingna , PAN Jianyu . Virtual screening of potential anti-osteoarthritic peptides from sea cucumber and their mechanisms based on network pharmacology, molecular docking, and quantum chemistry calculation*[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2025 , 44(6) : 176 -187 . DOI: 10.11978/2025011

*感谢匿名审稿专家提出的宝贵修改意见和建议。
骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种常见的慢性关节退行性疾病, 表现为关节软骨逐渐丧失, 导致功能障碍和疼痛(Wenham et al, 2013)。正常软骨的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)由II型胶原蛋白和蛋白聚糖构成, 维持关节结构与功能(Liu et al, 2016)。骨关节炎早期阶段, 炎症反应通过激活代谢通路、抑制基质合成及促进软骨细胞凋亡导致损伤(Wenham et al, 2013)。因此, 软骨稳态依赖于软骨细胞分化/凋亡与基质合成/降解的动态平衡, 而细胞因子失衡是破坏这种稳态的关键因素(Xiao et al, 2023)。研究发现, 骨关节炎患者关节内肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)和白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)等炎症因子水平升高, 通过激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)加速软骨退化(Houard et al, 2013; Greene et al, 2015)。此外, 白细胞介素-17(interleukin-17, IL-17)和TNF-α的协同作用还会促进白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、IL-6、白细胞介素-8(interleukin-8, IL-8)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)和MMPs等炎症介质的释放, 推动骨关节炎发展(Schinocca et al, 2021)。在受骨关节炎影响的关节中, 已发现白细胞介素(IL-17A)水平升高, IL-17诱导的转录变化与关节炎基因集的相关性支持IL-17A在骨关节炎病理生理学中的作用(Zhou et al, 2020), 抗IL-17治疗可能成为具有炎症表型的骨关节炎患者的潜在治疗选择。
当前骨关节炎临床治疗以物理疗法、药物(如副作用显著的肾上腺皮质激素)和手术为主, 但均无法有效逆转病程(Moreira et al, 2021)。因此, 亟需开发新的治疗策略。海洋活性肽因兼具抗炎与抗氧化特性成为研究焦点, 可能成为骨关节炎治疗的新方向(Xiong et al, 2022)。例如低分子量鱼胶肽(LMWCP)可促进软骨修复(Cho et al, 2023), 鱿鱼源II型胶原蛋白肽(SCIIP)通过TLR4/NF-κB通路抑制炎症反应(Zhao et al, 2024)。其抗氧化作用还体现在提升超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC), 减轻关节氧化损伤(孔德新 等, 2015)。
海参是栖息于潮间带和浅海的棘皮动物, 长期作为亚洲传统食材和药物。其富含多肽、多糖等活性成分, 这些活性成分具有抗炎、抗氧化及免疫调节作用(Hoang et al, 2022)。其中, 低分子量海参肽因其生物吸收性优于海参蛋白而受到关注(Shou et al, 2023)。研究显示, 海参肽具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和免疫调节等多重功能(Lu et al, 2022)。由上述关于骨关节炎的病理过程描述可知, 炎症反应和软骨细胞代谢失衡是核心机制, 而海参肽可通过调控IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子水平, 缓解炎症并促进软骨修复(Shou et al, 2023)。近年研究证实海参肽具有显著抗氧化与抗炎作用, 其通过调控miR-155/SOCS1通路降低促炎因子水平, 改善结肠炎症状(Mao et al, 2023), 还能剂量依赖性地抑制白细胞介素-4(Interleukin-4, IL-4)和白细胞介素-10(Interleukin-10, IL-10)等促炎因子释放(Feng et al, 2024)。同时, 海参肽(SP)可提升SOD和T-AOC, 缓解关节氧化损伤(Lee et al, 2021)。此外, 海参肠低分子量肽(SCIP)则通过调节炎症因子及促进巨噬细胞向M2型极化加速骨折愈合(Yin et al, 2023)。综上, 表明海参肽可能通过多靶点干预骨关节炎病理进程。
本研究基于海参蛋白数据库进行胃肠道酶解模拟, 结合在线工具对其活性、毒性及抗炎特性进行预测。利用网络药理学初筛潜在抗骨关节炎海参肽, 并采用分子对接与量子化学计算分析其潜在分子机制。该方案为高效发掘具有骨关节炎治疗潜力的海参肽提供了方法体系参考。

1 材料与方法

1.1 海参蛋白的蛋白序列

在Uniprot(网址: https://www.uniprot.org/; 访问日期2024-12-13)中查找海参蛋白。以“Holothuroidea”为关键词检索“Swiss-Prot”数据库, 选择基于“人工专家审核、深度文献挖掘、标准化注释和严格质量控制”的13条高质量海参蛋白数据(表1), 并分别下载其对应的fasta格式。
表1 选取的海参蛋白信息

Tab. 1 Information of selected sea cucumber proteins

UniProt检索号 蛋白检索名 蛋白名称 氨基酸总数 疏水性氨基酸比例 支链氨基酸比例
Q868M7 CEL3_CUCEC Galactose/N-acetylgalactosamine-binding lectin CEL-III, Gal/GalNAc-binding lectin CEL-III, CEL-III, Hemolytic lectin CEL-III, Lectin CEL-III 442 55.66% 17.65%
A0A286QZ36 RAC1_STIJA Ras-related protein Rac1, AjRac1 192 55.73% 23.44%
P80018 GLBC_MOLAR Globin C, coelomic 159 55.35% 22.01%
P48557 H2B_HOLTU Histone H2B 123 51.22% 15.45%
P15161 GLB1_PARCH Globin-1, Globin I 158 55.70% 22.15%
P80017 GLBD_MOLAR Globin D, coelomic 159 61.64% 12.58%
P21251 CALM_STIJA Calmodulin, CaM 149 52.35% 16.11%
Q9XY07 KARG_STIJA Arginine kinase, AK, EC:2.7.3.3 370 50.81% 19.73%
P62776 H4_HOLTU Histone H4 103 85.44% 70.87%
P28766 SODM_APOCL Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial, EC:1.15.1.1 144 69.44% 20.14%
P14309 PHI0_HOLTU Sperm-specific protein Phi-0 78 46.15% 6.41%
Q7M3Y0 SJL1_STIJA Lectin 1, Stichopus japonicas lectin 1, SjL-1 143 60.84% 11.19%
P19477 FIBA_APOPA Fibrinogen-like protein A, FREP-A 282 48.94% 16.67%

1.2 模拟胃肠消化道酶解与海参肽活性筛选

将13条海参蛋白fasta格式复制到peptide cutter (网址: https://web.expasy.org/peptide_cutter/; 访问日期: 2024-12-13)平台中, 选取胃蛋白酶(pepsin pH 1.3)、胰蛋白酶(trypsin)及高特异性胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin-high specificity)作为水解酶, 先用胃蛋白酶水解完后, 再将水解肽段用胰蛋白酶水解, 最后用胰凝乳蛋白酶进行虚拟酶解以模拟消化道酶对蛋白链的酶解过程, 将以上模拟酶解所得肽段去重、合并以获得海参肽段。
PeptideRanker是一款基于神经网络的生物肽活性预测工具, 可以对上传的肽段进行活性评估。预测结果中的概率值越高, 表明该肽具有生物活性的可能性越大。使用PeptideRanker (网址: http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/; 访问日期: 2024-12-14)进行活性预测, 并按照活性概率值大于0.5的标准筛选肽段。对于筛选出的具有活性的肽段, 进一步预测这些肽的毒性、过敏性及抗炎活性。毒性预测通过ToxinPred (网址: https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/; 访问日期: 2024-12-14)平台进行; 过敏性筛查则在AllerTOP v2.1 (网址: https://mybiosoftware.com; 访问日期: 2024-12-14)上完成; 抗炎活性通过CSM-peptides (网址: https://biosig.lab.uq.edu.au/csm_peptides/; 访问日期: 2024-12-14)平台预测。

1.3 网络药理学筛选抗骨关节炎潜在海参肽

利用GeneCards、OMIM、DisGeNET和TTD (Therapeutic Target Database)数据库, 以“osteoarthritis”为关键词检索相关的作用靶点, 合并数据库, 剔除重复靶点, 且从Genecards中选取相关评分高于中位数的基因靶点, 合并去重后作为疾病靶点库。将上述筛选出的海参肽序列通过SEA(http://sea.bkslab.org)进行靶点预测, 筛选掉相似系数低于0.5的靶点后, 并选择靶点信息中包含“human”的靶点, 将上述SEA预测靶点去重后作为海参肽基因靶点集合。将海参肽功能靶点库与疾病靶点库进行取交集处理, 所得到的交集数据库作为海参肽抑制骨关节炎基因靶点数据集。并在STRING(网址: https://cn.string-db.org)上构建蛋白互作网络, 利用Cytoscape软件的cytoHubba插件得到蛋白互作网络中核心模块和关键基因。得分Top10的关键基因靶点作为海参肽抑制骨关节炎的核心基因靶点。

1.4 通路富集分析

将海参肽抑制骨关节炎的基因靶点数据集导入到David 6.8数据库(网址: https://david.ncifcrf.gov/), 进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)途径和基因本体论(gene ontology, GO)富集分析。KEGG生物途径富集分析选择P<0.05的途径分析。GO富集分析包括细胞组分、分子功能和生物学过程三个方面, 分别选择P<0.05的途径进行分析。

1.5 分子对接

采用计算机模拟方法筛选潜在的活性多肽, 通过分子对接评估虚拟筛选所得多肽与潜在靶标蛋白之间的亲和力。使用Autodock软件将生物信息学筛选出来的多肽与目标蛋白对接, 筛选潜在的多肽。人源目标蛋白MMP9(8K5Y)、IL-17RA(5N9B)从PDB蛋白数据库下载, 多肽结构利用Gaussian view 5.0处理后得到多肽结构, 在对接之前, 去除构象中的水分子, 并对蛋白质进行氢化以进一步优化3D结构, 计算目标化合物在最小能量下的3D构象, 分析配体和对接受体之间的作用力, 根据对接结合能评分评估潜在活性物。

1.6 量子化学

量子化学计算是使用6-311G(d, p)基组的 B3LYP 密度泛函理论(DFT)(Lee et al, 1988)进行的, 采用Gauss view 5.0对最高占据的分子轨道(highest occupied molecular orbital, HOMO)和最低未占据分子轨道(lowest unoccupied molecular orbital, LUMO)进行可视化, 使用Gaussian 09软件计算化合物的化学反应描述符。整体化学反应性描述符是基于Koop-man理论(Koopmans, 1934)而定义, 如硬度(η)、柔软度(S)、电负性(χ) 和亲电指数(ω)。

2 结果与讨论

2.1 海参蛋白虚拟酶解与筛选肽氨基酸特征分析

将Uniprot(网址: https://www.uniprot.org/)中查找到的13条海参蛋白链先后用胃蛋白酶(pepsin, pH 1.3)、胰蛋白酶(trypsin)及高特异性胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin-high specificity)进行虚拟的模拟消化道酶解, 所获肽段去重合并后得到616个海参肽段。使用PeptideRanker预测得到活性概率值大于0.5的105个肽段。再利用CSM-peptides、ToxinPred和AllerTOP等平台预测105个肽段的抗炎活性、毒性及过敏性(见附表S1), 最后得到87个海参活性肽。
采用SeqLogo对87条不同长度肽的氨基酸分布, 其中较大的氨基酸字母对应与较高的出现百分比。如图1所展示的, 苯丙氨酸(phenylalanine, F)仍然是不同长度肽中的主要氨基酸, 其次是疏水氨基酸脯氨酸(proline, P)和色氨酸(tryptophan, W)。同时, 发现极性正电荷氨基酸—精氨酸(arginine, R)在各长度肽段中占比也较大。前期研究强调生物活性肽的抗炎特性受疏水氨基酸—缬氨酸(valine, V)、异亮氨酸(isoleucine, I)和脯氨酸 (proline, P)和极性带正电荷氨基酸—组氨酸(histidine, H)、精氨酸(arginine, R)和赖氨酸(lysine, K)的影响(Rivera-Jiménez et al, 2022)。经过预测, 筛选得到87条具有抗炎潜力的肽。为进一步挖掘其中能发挥抗骨关节炎作用的活性肽, 采用生物信息学筛选抑制骨关节炎的海参肽序列。
图1 87条海参肽库氨基酸分布比例

Fig. 1 Amino acid composition of 87 sea cucumber peptides

2.2 活性肽氨基酸特征分析与网络药理学

整合疾病数据库筛选靶点, 剔除重复靶点后得到1422个骨关节炎疾病潜在靶点库。将预测得到的87条海参肽序列经靶点预测后得到114个海参肽基因靶点, 将其作为海参肽功能靶点集合。将上述潜在骨关节炎疾病靶点和潜在海参肽抑制骨关节炎基因靶点取交集, 得到43个潜在海参活性肽抑制骨关节炎基因靶点(图2a)及其对应的活性肽氨基酸序列, 再将活性肽序列去重后得到24条潜在活性肽(AW、ERF、GHSR、KWVF、YGRL、EF、GW、FL、FDPVIEEYHNGF、RR、NGQYYDYSGAPSIYWSYL、APR、DFPDGR、SPGPY、GR、LVW、APGDR、DAW、GVIF、FAYDPAAQNKF、NDHGF、DDW、GIW、TW)。
图2 海参抗骨关节炎活性肽氨基酸序列特征和靶点分析

a. 骨关节炎疾病库基因靶点与潜在海参肽对应基因靶点交集Veen图; b. 24条肽特征氨基酸数量; c. 24条肽特征氨基酸占比; d. 潜在抑制骨关节炎海参活性肽的蛋白互作网络图; e. PPI中前十的基因靶点

Fig. 2 Amino acid sequence characteristics and target analysis of anti-osteoarthritis peptides from sea cucumber. (a) Veen diagram showing the intersection between OA-related gene targets and potential sea cucumber peptide targets; (b) characteristic amino acid composition of 24 peptides; (c) characteristic amino acid counts of 24 peptides; (d) protein-protein interaction (PPI) network of potential anti-OA sea cucumber peptides; (e) top ten gene targets in the PPI network

抗氧化肽通常富含某些特定的氨基酸, 如脯氨酸(P)、组氨酸(H)和酪氨酸(tyrosine, Y), 这些氨基酸有助于自由基的清除和抗氧化酶的激活(Hu et al, 2023)。疏水性氨基酸在抗氧化肽中也较为常见, 它们可能通过与自由基或脂质过氧化物相互作用来增强抗氧化能力(Nielsen et al, 2017)。此外, 肽中的疏水性氨基酸也可能通过干扰炎症途径级联反应参与抗炎机制 (Kemp et al, 2021)。因此, 我们重点对疏水性氨基酸和抗氧化肽通常富含的特定氨基酸的数量与比例进行分析, 图2b、c中可直接观察到疏水性氨基酸占比为43.36%, 抗氧化肽富含特征氨基酸总占比为18.18%。在疏水性氨基酸中, 脯氨酸(P)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸(alanine, A)的数量是最多, 可以推测这24条肽整体的抗炎、抗氧化能力较强。
将上述取交集得到的43个潜在海参活性肽抑制骨关节炎基因靶点输入到string中构建蛋白互作网络(protein-protein interaction networks, PPI), 利用cytoscape进行可视化分析。如图2d, 得到54个节点、322条边的PPI。利用Cytosape中CytoHubba插件获取排名TOP10关键基因靶点(图2e)。

2.3 海参肽抑制骨关节炎的潜在通路机制

对43个潜在海参活性肽抑制骨关节炎基因靶点在分子生物学功能、生物学过程和细胞学组分进行三个层面的GO富集分析, 以阐明候选靶标可能发挥的作用。富集分析的结果共获得121个生物过程、27个细胞成分和39个分子功能, 根据count值从大到小, 分别选取三种GO注释分析前10个代表性聚类进行可视化(图3a)。在生物学过程中, 差异基因富集结果主要涉及蛋白水解、胶原蛋白分解代谢过程、细胞外基质拆卸、炎症反应; 细胞成分中, 主要富集在质膜、细胞外间隙、细胞外区域、含胶原的外泌体; 分子功能中, 主要富集在蛋白质结合、金属内肽酶活性、纤连蛋白结合、胶原蛋白结合等。
图3 GO富集分析图(a)与KEGG富集分析图(b)

Fig. 3 GO enrichment analysis (a) and KEGG enrichment analysis (b)

为了探索海参生物活性肽抑制骨关节炎的可能机制, 通过对43个主要靶点的KEGG信号通路的分析, 共获得36条信号通路。根据对count值从大到小排序进行可视化构建，如图3b所示。KEGG富集通路中包含多条与良性前列腺增生相关的信号通路, 如癌症途径、类风湿性关节炎、IL-17信号通路、TNF信号通路等。
如前所述, IL-17及其信号通路在骨关节炎发病机制中发挥重要作用, 通过调节软骨基质降解和炎症反应促进骨关节炎进展(Zhou et al, 2020)。IL-17家族是一类结构相似的炎症分子, 其中IL-17RA会通过与其他受体亚基结合并相互作用来发挥多效性功能(Lorè et al, 2021)。在炎性环境中, IL-17通过与各种促炎细胞因子(如TNF-α等)、金属蛋白酶家族 (MMPs)、趋化因子等炎性介质来参与骨关节炎的发病机制, 导致关节软骨代谢稳态丧失(Mohd Heikal et al, 2019)。研究表明, 调节IL-17信号通路是治疗骨关节炎的有效策略(Xiao et al, 2023)。结合KEGG和GO的富集结果, 海参肽抑制骨关节炎的可能途径是 IL-17 信号通路、TNF 信号通路, 通过抑制炎症、细胞外基质胶原分解和细胞外基质降解来缓解骨关节炎。同时, IL-17也被选择作为后续分子对接的靶蛋白, 有助于深入探讨海参肽在调节IL-17信号通路方面的潜在作用, 为阐明其抗骨关节炎机制提供依据。

2.4 分子对接

为分析由网络药理学筛选出来的24条海参肽与疾病靶点MMP9(PDB:1IKN)和IL-17RA(PDB:5N9B)目标蛋白受体间的相互作用, 进一步筛选骨关节炎抑制海参肽, 利用分子对接技术以结合能作为评价标准。同时, 将两条已知抗OA效果较好的海洋来源活性肽(LMWCP、SCIIP)(Cho et al, 2023, Zhao et al, 2024)也与MMP9、IL-17RA蛋白进行分子对接, 可参考其结合能筛选潜在高活性肽。对接结合能结果如表2所示, 肽与MMP9和IL-17RA受体蛋白间存在不同程度的结合。
表2 24条海参肽分子对接结合能

Tab. 2 Molecular docking binding energies of 24 sea cucumber peptides

肽序列 对接结合能(kcal·mol-1)
MMP9(8K5Y) IL-17RA(5N9B)
FDPVIEEYHNGF -9.1 -7.0
KWVF -8.4 -6.7
SPGPY -8.1 -6.9
DDW -7.9 -6.3
YGRL -7.8 -6.6
LMWCP* -7.8 -6.4
DFPDGR -7.5 -6.6
GHSR -7.3 -5.8
DAW -7.2 -6.2
TW -7.2 -6.7
GW -7.1 -6.3
GROW -6.7 -7.0
APGDR -6.6 -6.0
APR -6.6 -6.4
AW -6.6 -6.2
LVW -6.6 -6.3
FAYDPAAQNKF -6.3 -8.0
GVIF -6.3 -6.1
NDHGF -6.3 -6.3
ERF -6.1 -5.8
FL -6.1 -5.5
RR -6.1 -5.8
SCIIP* -6.0 -5.3
NGQYYDYSGAPSIYWSYL -5.7 -6.4
GR -5.6 -5.0
EF -5.5 -5.5

注: *表示该肽为已报道对骨关节炎有缓解作用的海洋生物肽, 在此为阳性肽作为筛选参考。

如表2所示, LMWCP、SCIIP与MMP9蛋白的对接结合能分别为-7.8和-6.0kcal·mol-1。多肽配体与靶蛋白间的结合活性可通过结合能评估, 结合能越低, 两者间结合越紧密。FDPVIEEYHNGF、KWVF、SPGPY、DDW、YGRL与MMP9蛋白的结合能分别为-9.1、-8.4、-8.1、-7.9和-7.8kcal·mol-1, 结合较紧密。LMWCP、SCIIP与IL-17RA蛋白的对接结合能分别为-6.4 、-5.3kcal·mol-1, 而FAYDPAAQNKF、FDPVIEEYHNGF、GIW、SPGPY和KWVF与IL-17RA蛋白结合较紧密, 结合能分别为-8.0、-7.0、-7.0、-6.9和-6.7kcal·mol-1。其中, 与两个靶蛋白结合紧密的肽中, FDPVIEEYHNGF、KWVF和SPGPY重复出现。从对接结合能结果可知, 相较于目前已报道的抗骨关节炎活性肽, 以上三个重复肽与靶蛋白受体之间具有更强的亲和力, 表明它们与骨关节炎潜在作用靶蛋白具有良好的结合亲和力。图4展示了三条肽的对接情况, 三条肽能和靶蛋白氨基酸残基间形成较强的分子间作用力, 具有稳定的结合能力, 能够更有效地结合骨关节炎的相关重要靶点, 从而干预通路并产生缓解骨关节炎的效果。
图4 SPGPY、KWVF、FDPVIEEYHNGF分别与MMP9、IL-17RA靶蛋白间的分子对接可视化图

Fig. 4 Molecular docking visualization between SPGPY, KWVF, FDPVIEEYHNGF and their respective target proteins MMP9 and IL-17RA

2.5 量子化学

基于密度泛函理论(density functional theory, DFT)在B3LYP/6-31G水平上对以上三个候选肽进行了量子化学计算。最高占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO)在影响分子活性方面发挥着巨大的作用, 分子的HOMO和LUMO能级差(ΔEHOMO-LUMO)越小, 分子活性越强(Morell et al, 2005), 三个候选肽(FDPVIEEYHNGF、KWVF、SPGPY)与两个阳性对照肽(LMWCP、SCIIP)的ΔEHOMO-LUMO分别为0.14393、0.19333、0.21724、0.18064和0.17773kJ·mol-1。图5所示, 发现FDPVIEEYHNGF的ΔEHOMO-LUMO比两条已报道的活性肽具有更低的轨道能量差, 分子活力强于两条阳性对照肽, 推测FDPVIEEYHNGF具有较好抑制骨关节炎的潜力。
图5 FDPVIEEYHNGF、KWVF、SPGPY、SCIIP和LMWCP的HOMO与LUMO轨道能量差

Fig. 5 HOMO-LUMO energy gaps of FDPVIEEYHNGF, KWVF, SPGPY, SCIIP and LMWCP

HOMO和LUMO能量也可以用来计算化学反应描述符。软度(S)、电负性(χ) 和亲电指数(ω), 分别可以用于描述分子中电子迁移能力、分子吸引电子的能力和分子的亲电能力(Shaaban et al, 2023)。由表3可知, FDPVIEEYHNGF、SPGPY的电负性相对而言较大, 吸引电子的能力也越强, 给出电子的能力越弱, 可以作为电子受体。从中发现相较于两条阳性对照肽的电负性、软度和亲电性值, FDPVIEEYHNGF的电负性相对较大, 说明它是良好的电子接受体, 可以更好地清除体内的自由基, 从而可以发挥抗氧化、抗炎作用, 进而可以预测FDPVIEEYHNGF具有较强的抗炎活性。
表3 化学反应描述符值

Tab. 3 Chemical reactivity descriptor values

参数 KWVF FDPVIEEYHNGF SPGPY LMWCP SCIIP
EHOMO/(kJ·mol-1) -0.00567 -0.06577 -0.00885 -0.02392 -0.03917
ELUMO/(kJ·mol-1) -0.199 -0.2097 -0.22609 -0.20165 -0.21981
ΔEHOMO-LUMO 0.19333 0.14393 0.21724 0.17773 0.18064
I=-EHOMO 0.00567 0.06577 0.00885 0.02392 0.03917
A=-ELUMO 0.199 0.2097 0.22609 0.20165 0.21981
χ=(I+A)/2 0.102335 0.137735 0.11747 0.112785 0.12949
μ=-(I+A)/2 -0.102335 -0.137735 -0.11747 -0.112785 -0.12949
η= (I-A)/2 0.096665 0.071965 -0.10862 -0.088865 -0.09032
S= 1/η 10.34500595 13.89564372 -9.20640766 -11.25302425 -11.07174491
ω= μ2/2η 0.05416879 0.131806644 -0.063520534 -0.071571801 -0.092823628

注: EHOMO, 最高占据分子轨道能量EHOMO能隙 (∆E); ELUMO, 最高占据分子轨道能量EHOMO能隙; ΔEHOMO-LUMO, 最高和最低占据分子轨道能差; χ, 绝对电负性; μ, 化学势; η, 绝对硬度; S, 化学软度; ω, 全局亲电性。

据文献报道, 抗氧化肽通常富含如脯氨酸(P)、组氨酸(H)和酪氨酸(Y)等特定氨基酸, 疏水性氨基酸在其中也较为常见(Nielsen et al, 2017; Hu et al, 2023)。同时, 疏水性氨基酸还可能参与抗炎机制, 干扰炎症途径级联反应(Kemp et al, 2021)。抗炎肽通常为短链小分子肽, 这有利于其被人体吸收, 当氨基酸长度在2~20个氨基酸之间, 这种短链结构有助于其穿透肠道屏障并进入血液循环(Nielsen et al, 2017)。FDPVIEEYHNGF中包含脯氨酸(P)、组氨酸(H)、酪氨酸(Y)这些抗氧肽具有的特征氨基酸, 其中的疏水性氨基酸在该肽中的占比41.67%, 具有潜在良好的抗氧化和抗炎活性。同时, FDPVIEEYHNGF氨基酸组成长度为12(<20), 该长度有助于提高人体吸收率。

3 结论

本文以海参蛋白为研究对象, 结合计算机模拟胃肠道酶解和在线数据库预测的方法, 筛选出海参中可能具有生物活性的肽段。通过网络药理学、分子对接和量子化学计算虚拟筛选, 鉴定出一条潜在的抗骨关节炎活性较强的海参候选肽(FDPVIEEYHNGF)。本文还通过“成分—靶点—疾病”网络图的拓扑分析、GO和KEGG富集分析, 结合核心靶点的综合分析, 推测海参肽可能通过调控IL-17信号通路和TNF信号通路, 抑制炎症反应、细胞外基质中胶原的降解以及基质金属蛋白酶(MMPs)活性, 从而缓解骨关节炎。此外, 海参肽能够通过与骨关节炎潜在核心靶点MMP9和IL-17RA蛋白受体形成氢键, 进而影响相关信号通路, 减轻炎症反应, 调节MMP3、MMP9和MMP14基因的表达, 干预细胞外基质重塑, 减少对胶原的破坏, 从而改善骨关节炎病症。该研究为海参肽的生物活性提供了新的视角, 然而, 虚拟筛选结果需要通过实验验证来确认其生物活性和机制。未来的研究应重点关注合成和纯化海参肽FDPVIEEYHNGF, 评估其在体外骨关节炎细胞模型中的抗炎和调节MMPs活性的效果, 以及在骨关节炎动物模型中的疗效和机制研究, 为开发基于海参肽缓解骨关节炎的海洋先导化合物提供快速筛选的思路。
附表1 105条肽的反应活性、抗炎活性、毒性及过敏性预测结果
附表1 105条肽的反应活性、抗炎活性、毒性及过敏性预测结果

Appendix Tab. 1 Predicted reactivity, anti-inflammatory activity, toxicity and allergenicity of 105 peptides

肽序列 活性预测 抗炎活性预测 毒性预测 过敏性预测
MVSLVPCGF 0.732412 阴性 (0.09) 无毒性 低过敏性
QGMCLDVEGSDGSGNVGIY 0.522422 阴性 (0.11) 无毒性 低过敏性
SGGSYCNGQWVDVHT 0.515439 阴性 (0.15) 无毒性 低过敏性
AYHNTMRF 0.809287 阴性 (0.18) 无毒性 低过敏性
CANEDCTF 0.668399 阴性 (0.23) 无毒性 低过敏性
FTNDQF 0.561741 阴性 (0.26) 无毒性 低过敏性
SGDLLVW 0.687684 阴性 (0.26) 毒性 高过敏性
AVLCPPAK 0.575315 阴性 (0.3) 毒性 低过敏性
TW 0.814447 —————————— 无毒性 低过敏性
GVIF 0.679797 阳性 (0.91) 无毒性 低过敏性
INHCIF 0.814483 阴性 (0.32) 无毒性 低过敏性
VF 0.815398 —————————— 无毒性 低过敏性
TW 0.814447 —————————— 无毒性 低过敏性
GVIF 0.679797 阳性 (0.91) 无毒性 低过敏性
LVPCG 0.555399 阳性 (0.97) 无毒性 低过敏性
NDHGF 0.73823 阳性 (0.97) 无毒性 低过敏性
LYG 0.571687 阳性 (0.98) 无毒性 低过敏性
SPGPY 0.834009 阳性(0.69) 无毒性 低过敏性
IF 0.949173 —————————— 无毒性 低过敏性
IG 0.501816 —————————— 无毒性 低过敏性
LF 0.986934 —————————— 无毒性 低过敏性
LL 0.618551 —————————— 无毒性 低过敏性
LR 0.569984 —————————— 无毒性 低过敏性
MR 0.849148 —————————— 无毒性 低过敏性
IF 0.949173 —————————— 无毒性 低过敏性
TRGCMWQ 0.562712 阴性 (0.33) 无毒性 低过敏性
SLADPAGR 0.560956 阴性 (0.34) 无毒性 低过敏性
LYPEIPSSQRWRL 0.73744 阴性 (0.36) 无毒性 低过敏性
LPGDNDQIPF 0.642526 阴性 (0.39) 无毒性 低过敏性
FAYDPSAQNKF 0.666363 阴性 (0.41) 无毒性 低过敏性
DDFPNF 0.927081 阴性 (0.42) 无毒性 低过敏性
PHMAKDKRFEEICTKMRL 0.767377 阴性 (0.47) 无毒性 低过敏性
CSCYPDWMAIPGSGCY 0.929117 阳性 (0.54) 毒性 高过敏性
FTSGGMARDFPDGRGIWHNDKKNFL 0.57984 阳性 (0.51) 无毒性 低过敏性
STW 0.608876 阳性 (0.52) 无毒性 低过敏性
SNTAPGCAPF 0.746688 阳性 (0.52) 无毒性 低过敏性
CSF 0.938752 阳性 (0.55) 无毒性 低过敏性
FGS 0.848001 阳性 (0.55) 无毒性 低过敏性
GAW 0.95923 阳性 (0.55) 无毒性 低过敏性
GPELF 0.799842 阳性 (0.55) 无毒性 低过敏性
NGQYYDYSGAPSIYWSYL 0.592428 阳性 (0.56) 无毒性 低过敏性
AAAHAEGDIGGMIALQPALNGGGINHCIF 0.530885 阳性 (0.56) 无毒性 低过敏性
GAY 0.546287 阳性 (0.58) 无毒性 低过敏性
QNW 0.769836 阳性 (0.58) 无毒性 低过敏性
MGGT 0.589573 阳性 (0.59) 无毒性 低过敏性
LVW 0.679093 阳性 (0.6) 无毒性 低过敏性
NGGG 0.630468 阳性 (0.62) 无毒性 低过敏性
GMALSPHVCR 0.630588 阳性 (0.62) 无毒性 低过敏性
PDQRF 0.818055 阳性 (0.62) 无毒性 低过敏性
WTN 0.511211 阳性 (0.62) 无毒性 低过敏性
LGR 0.620526 阳性 (0.63) 无毒性 低过敏性
APGDR 0.611329 阳性 (0.63) 无毒性 低过敏性
MQAIKCVVVGDGAVGKTCL 0.596152 阳性 (0.64) 无毒性 低过敏性
TGF 0.837013 阳性 (0.64) 无毒性 低过敏性
APR 0.649879 阳性 (0.65) 无毒性 低过敏性
FSPGPYG 0.903072 阳性 (0.65) 无毒性 低过敏性
MSGR 0.598963 阳性 (0.66) 无毒性 低过敏性
PEF 0.723457 阳性 (0.68) 无毒性 低过敏性
LPGDNDQIPF 0.642526 阴性 (0.39) 无毒性 低过敏性
FAYDPSAQNKF 0.666363 阴性 (0.41) 无毒性 低过敏性
DDFPNF 0.927081 阴性 (0.42) 无毒性 低过敏性
PHMAKDKRFEEICTKMRL 0.767377 阴性 (0.47) 无毒性 低过敏性
CSCYPDWMAIPGSGCY 0.929117 阳性 (0.54) 毒性 高过敏性
FTSGGMARDFPDGRGIWHNDKKNFL 0.57984 阳性 (0.51) 无毒性 低过敏性
STW 0.608876 阳性 (0.52) 无毒性 低过敏性
SNTAPGCAPF 0.746688 阳性 (0.52) 无毒性 低过敏性
CSF 0.938752 阳性 (0.55) 无毒性 低过敏性
FGS 0.848001 阳性 (0.55) 无毒性 低过敏性
GAW 0.95923 阳性 (0.55) 无毒性 低过敏性
GPELF 0.799842 阳性 (0.55) 无毒性 低过敏性
NGQYYDYSGAPSIYWSYL 0.592428 阳性 (0.56) 无毒性 低过敏性
AAAHAEGDIGGMIALQPALNGGGINHCIF 0.530885 阳性 (0.56) 无毒性 低过敏性
GAY 0.546287 阳性 (0.58) 无毒性 低过敏性
QNW 0.769836 阳性 (0.58) 无毒性 低过敏性
MGGT 0.589573 阳性 (0.59) 无毒性 低过敏性
LVW 0.679093 阳性 (0.6) 无毒性 低过敏性
NGGG 0.630468 阳性 (0.62) 无毒性 低过敏性
GMALSPHVCR 0.630588 阳性 (0.62) 无毒性 低过敏性
PDQRF 0.818055 阳性 (0.62) 无毒性 低过敏性
WTN 0.511211 阳性 (0.62) 无毒性 低过敏性
LGR 0.620526 阳性 (0.63) 无毒性 低过敏性
APGDR 0.611329 阳性 (0.63) 无毒性 低过敏性
MQAIKCVVVGDGAVGKTCL 0.596152 阳性 (0.64) 无毒性 低过敏性
TGF 0.837013 阳性 (0.64) 无毒性 低过敏性
APR 0.649879 阳性 (0.65) 无毒性 低过敏性
FSPGPYG 0.903072 阳性 (0.65) 无毒性 低过敏性
MSGR 0.598963 阳性 (0.66) 无毒性 低过敏性
PEF 0.723457 阳性 (0.68) 无毒性 低过敏性
PNF 0.937503 阳性 (0.7) 无毒性 低过敏性
DEAIRAVLCPPAKNKSKRSCQ 0.556741 阳性 (0.71) 无毒性 低过敏性
SCEDNLDQW 0.551231 阳性 (0.72) 无毒性 低过敏性
YGRL 0.758053 阳性 (0.72) 无毒性 低过敏性
DAW 0.81178 阳性 (0.73) 无毒性 低过敏性
STYDNDNDVYSINCASHSSYGRGAWWYKSCL 0.894838 阳性 (0.73) 无毒性 低过敏性
DQMW 0.873162 阳性 (0.74) 无毒性 低过敏性
FDPVIEEYHNGF 0.613992 阳性 (0.74) 无毒性 低过敏性
CNGQW 0.83143 阳性 (0.75) 无毒性 低过敏性
LQPAL 0.573567 阳性 (0.75) 无毒性 低过敏性
SDQQIIMCGDGTIRNEARNYC 0.771888 阳性 (0.76) 无毒性 低过敏性
CNGDY 0.565136 阳性 (0.77) 无毒性 低过敏性
KWVF 0.877281 阳性 (0.78) 无毒性 低过敏性
TSF 0.503464 阳性 (0.78) 无毒性 低过敏性
FAYDPAAQNKF 0.665849 阳性 (0.79) 无毒性 低过敏性
CGNDPNAHPDGY 0.545128 阳性 (0.82) 无毒性 低过敏性
FKCKL 0.73601 阳性 (0.82) 无毒性 低过敏性
VWNPQIIKCTRSNTAPGCAP 0.570157 阳性 (0.83) 无毒性 低过敏性
DFPDGR 0.836716 阳性 (0.85) 无毒性 低过敏性
HNGF 0.825278 阳性 (0.85) 无毒性 低过敏性
CSCYPDWMAIPGSGCYKYVDTPKT 0.744716 阳性 (0.86) 无毒性 低过敏性
DQW 0.7393 阳性 (0.87) 无毒性 低过敏性
GCMW 0.990831 阳性 (0.88) 无毒性 低过敏性
GIW 0.954702 阳性 (0.88) 无毒性 低过敏性
ERF 0.623648 阳性 (0.89) 无毒性 低过敏性
CDDLR 0.538337 阳性 (0.9) 无毒性 低过敏性
DSW 0.733247 阳性 (0.9) 无毒性 低过敏性
GGG 0.871626 阳性 (0.9) 无毒性 低过敏性
DCY 0.64835 阳性 (0.94) 无毒性 低过敏性
DDW 0.7639 阳性 (0.94) 无毒性 低过敏性
AF 0.973259 —————————— 无毒性 低过敏性
AW 0.9669 —————————— 无毒性 低过敏性
CF 0.99641 —————————— 无毒性 低过敏性
DF 0.942412 —————————— 无毒性 低过敏性
EF 0.598976 —————————— 无毒性 低过敏性
FL 0.989567 —————————— 无毒性 低过敏性
GF 0.994712 —————————— 无毒性 低过敏性
GG 0.88736 —————————— 无毒性 低过敏性
GH 0.530477 —————————— 无毒性 低过敏性
GL 0.808777 —————————— 无毒性 低过敏性
GR 0.766288 —————————— 无毒性 低过敏性
GW 0.993164 —————————— 无毒性 低过敏性
HF 0.950971 —————————— 无毒性 低过敏性
IC 0.663199 —————————— 无毒性 低过敏性
NF 0.941145 —————————— 无毒性 低过敏性
RL 0.626352 —————————— 无毒性 低过敏性
RR 0.565498 —————————— 无毒性 低过敏性
SW 0.93391 —————————— 无毒性 低过敏性
TF 0.826678 —————————— 无毒性 低过敏性

References

Publishing order | Descend order by publishing year | Descend order by cited within
[1]
孔德新, 陈雪红, 谢靖, 等, 2015. 狭鳕鱼皮胶原蛋白肽对大鼠关节炎模型中氧化应激和炎症因子的影响[J]. 安徽农业科学, 43(26): 132-134.

KONG DEXIN, CHEN XUEHONG, XIE JING, et al, 2015. Effect of collagen peptides from walleye pollock skin on oxidative stress and inflammatory cytokine in osteoarthritis rats[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 43(26): 132-134 (in Chinese with English abstract).

[2]
CHO W, PARK J, KIM J, et al, 2023. Low-molecular-weight fish collagen peptide (valine-glycine-proline-hydroxyproline-glycine-proline-alanine-glycine) prevents osteoarthritis symptoms in chondrocytes and monoiodoacetate-injected rats[J]. Marine Drugs, 21(12): 608.

DOI

[3]
FENG JIANHUI, WANG HAOJIE, LUO XINYUE, et al, 2024. Identification and molecular mechanism of the anti-inflammatory effect of sea cucumber peptides: Network pharmacology, molecular docking and animal experiments[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 279(Pt 2): 134958.

DOI

[4]
GREENE M A, LOESER R F, 2015. Aging-related inflammation in osteoarthritis[J]. Osteoarthritis and Cartilage, 23(11): 1966-1971.

DOI PMID

[5]
HOANG T H, LIANG QI, LUO XUAN, et al, 2022. Bioactives from marine animals: potential benefits for human reproductive health[J]. Frontiers in Marine Science, 9: 872775.

DOI

[6]
HOUARD X, GOLDRING M B, BERENBAUM F, 2013. Homeostatic mechanisms in articular cartilage and role of inflammation in osteoarthritis[J]. Current Rheumatology Reports, 15(11): 375.

DOI PMID

[7]
HU YUXI, NI CE, WANG YINGYING, et al, 2023. Research progress on the preparation and function of antioxidant peptides from walnuts[J]. International Journal of Molecular Sciences, 24(19): 14853.

DOI

[8]
KEMP D C, KWON J Y, 2021. Fish and shellfish-derived anti-inflammatory protein products: properties and mechanisms[J]. Molecules, 26(11): 3225.

DOI

[9]
KOOPMANS T, 1934. The classification of wave functions and eigenvalues to the single electrons of an atom[J]. Physica, 1: 104-113.

DOI

[10]
LEE CHENGTEH, YANG WEITAO, PARR R G, 1988. Development of the Colle-Salvetti correlation-energy formula into a functional of the electron density[J]. Physical Review B, 37(2): 785-789.

DOI PMID

[11]
LEE H G, KIM H S, OH J Y, et al, 2021. Potential antioxidant properties of enzymatic hydrolysates from Stichopus japonicus against hydrogen peroxide-induced oxidative stress[J]. Antioxidants, 10(1): 110.

DOI

[12]
LIU QIANG, HU XIAOQING, ZHANG XIN, et al, 2016. Effects of mechanical stress on chondrocyte phenotype and chondrocyte extracellular matrix expression[J]. Scientific Reports, 6: 37268.

DOI PMID

[13]
LU ZHIQIANG, SUN NA, DONG LIU, et al, 2022. Production of bioactive peptides from sea cucumber and its potential health benefits: a comprehensive review[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 70(25): 7607-7625.

DOI PMID

[14]
LORÈ N I, CHEN KONG, BULEK K, 2021. Editorial: the IL-17 cytokine family in tissue homeostasis and disease[J]. Frontiers in Immunology, 12: 641986.

DOI

[15]
MAO JING, ZHAO YUNJIAO, WANG LECHEN, et al, 2023. Sea cucumber peptide alleviates ulcerative colitis induced by dextran sulfate sodium by alleviating gut microbiota imbalance and regulating miR-155/SOCS1 axis in mice[J]. Foods, 12(18): 3434.

DOI

[16]
MOHD HEIKAL M Y, AHMAD NAZRUN S, CHUA K H, et al, 2019. Stichopus chloronotus aqueous extract as a chondroprotective agent for human chondrocytes isolated from osteoarthitis articular cartilage in vitro[J]. Cytotechnology, 71(2): 521-537.

DOI

[17]
MOREIRA F R C, DE OLIVEIRA T A, RAMOS N E, et al, 2021. The role of renin angiotensin system in the pathophysiology of rheumatoid arthritis[J]. Molecular Biology Reports, 48(9): 6619-6629.

DOI PMID

[18]
MORELL C, GRAND A, TORO-LABBÉ A, 2005. New dual descriptor for chemical reactivity[J]. The Journal of Physical Chemistry A, 109(1): 205-212.

DOI

[19]
NIELSEN S D, BEVERLY R L, QU YUNYAO, et al, 2017. Milk bioactive peptide database: a comprehensive database of milk protein-derived bioactive peptides and novel visualization[J]. Food Chemistry, 232: 673-682.

DOI PMID

[20]
RIVERA-JIMÉNEZ J, BERRAQUERO-GARCÍA C, PÉREZ-GÁLVEZ R, et al, 2022. Peptides and protein hydrolysates exhibiting anti-inflammatory activity: sources, structural features and modulation mechanisms[J]. Food & Function, 13(24): 12510-12540.

[21]
SCHINOCCA C, RIZZO C, FASANO S, et al, 2021. Role of the IL-23/IL-17 pathway in rheumatic diseases: an overview[J]. Frontiers in Immunology, 12: 637829.

DOI

[22]
SHAABAN S, ABDOU A, ALHAMZANI A G, et al, 2023. Synthesis and in silico investigation of organoselenium-clubbed schiff bases as potential mpro inhibitors for the SARS-CoV-2 replication[J]. Life, 13(4): 912.

DOI

[23]
SHOU YIWEN, FENG CHAO, LU QINPEI, et al, 2023. Research progress on the chemical components and biological activities of sea cucumber polypeptides[J]. Frontiers in Pharmacology, 14: 1290175.

DOI

[24]
WENHAM C Y J, CONAGHAN P G, 2013. New horizons in osteoarthritis[J]. Age and Ageing, 42(3): 272-278.

DOI PMID

[25]
XIAO JUAN, ZHANG PING, CAI FANGLAN, et al, 2023. IL-17 in osteoarthritis: a narrative review[J]. Open Life Sciences, 18(1): 20220747.

DOI

[26]
XIONG LING, LUO TAO, WANG LUANFENG, et al, 2022. Potential of food protein-derived peptides for the improvement of osteoarthritis[J]. Trends in Food Science & Technology, 129: 544-557.

[27]
YIN HAOWEN, YUE HAO, WANG MENG, et al, 2023. Peptides from sea cucumber intestine: preparation and promoting cartilage callus formation in mice with tibial fractures by promoting the polarization of M1 to M2 macrophages[J]. Journal of Functional Foods, 108: 105718.

DOI

[28]
ZHAO QIANQIAN, LI ZHAOXIA, LIU ZEYU, et al, 2024. Preparation, typical structural characteristics and relieving effects on osteoarthritis of squid cartilage type II collagen peptides[J]. Food Research International, 191: 114697.

DOI

[29]
ZHOU XINDIE, LI JIN, ZHOU YUANSHUAI, et al, 2020. Down-regulated ciRS-7/up-regulated miR-7 axis aggravated cartilage degradation and autophagy defection by PI3K/AKT/mTOR activation mediated by IL-17A in osteoarthritis[J]. Aging, 12(20): 20163-20183.

DOI

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