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Journal of Tropical Oceanography >

2017 , Vol. 36 >Issue 1: 48 - 55

DOI: https://doi.org/10.11978/2016022

Orginal Article

Molecular cloning and expression analysis of Commd1 under salinity stress in Crassostrea hongkongensis

  • WANG Fuxuan , 1, 2 ,
  • XIAO Shu 1 ,
  • XIANG Zhiming , 1 ,
  • YU Ziniu , 1
Expand
  • 1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Corresponding author: YU Ziniu. E-mail:; XIANG Zhiming. E-mail:

Received date: 2016-03-01

  Request revised date: 2016-08-26

  Online published: 2017-01-19

Supported by

National Natural Science Foundation of China (31572661, 31202021, 31272658)

Science and Technology Program of Guangzhou, China (201605120657132)

Copyright

热带海洋学报编辑部
Fold

Abstract

COMMDs are recently discovered in many multicellular organisms. They are involved in numerous aspects of biological processes, such as the regulation of copper homeostasis, the transport of sodium ions, the activity of the transcription factors NF-κB, and hypoxia-inducible factor (HIF-1). To investigate the role of Commd1 in response to salt stress, we first cloned Commd1 cDNA using Rapid Amplification of the cDNA Ends (RACE) technique in mollusks, Crassostrea hongkongensis (designed ChCommd1). The full-length cDNA is 841 bp containing a 5′-untranslated region (UTR) in 18 bp, a 3′-UTR in 262 bp with a poly (A) tail, and an open reading frame (ORF) in 564 bp; the ORF encodes a 187 amino-acid polypeptide with a predicted molecular mass of 21.79 kDa and an isoelectric point of 5.21. Homologous comparison and phylogenetic analysis revealed that the 187-aa-long ChCOMMD1 protein shares high sequence identity with its homologs from other species and belongs to the molluscan COMMD1 family. Quantitative real-time PCR analysis showed that ChCommd1 mRNA is broadly expressed in various tissues and during different stages of the oyster’s embryonic and larval development. Upon exposure to two stressors (high and low salinity), the expression level of ChCommd1 mRNA increased significantly. Taken together, our results indicated that ChCommd1 can function in the embryonic development and osmotic regulation, providing an important reference for further investigations on the functions of Commd1 in the euryhaline mollusks.

Key words： C. hongkongensis; Commd1; gene expression; salinity stress

Cite this article

WANG Fuxuan , XIAO Shu , XIANG Zhiming , YU Ziniu . Molecular cloning and expression analysis of Commd1 under salinity stress in Crassostrea hongkongensis[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2017 , 36(1) : 48 -55 . DOI: 10.11978/2016022

COMMD蛋白家族是近年来新发现的一类进化高度保守的因子, 广泛存在于很多生物体中, 结构独特并具有某些相同的功能性质(贺洪军 等, 2011)。目前为止, COMMD蛋白家族共有十个成员 (COMMD1-10), 每个成员的羧基末端都存在一段高度保守且唯一的结构域(约70~85个氨基酸), 即COMM结构域(Jin et al, 2012)。COMM结构域不仅仅定义了COMMD蛋白家族, 而且可为蛋白间相互作用提供一个重要的界面(Maine et al, 2007)。一方面, 此结构域介导了COMMD1与COMMD家族其他成员间的相互作用, 同样也包括COMMD1蛋白本身在内(Materia et al, 2012); 另一方面, COMMD与其他蛋白的结合也是通过此结构域完成的, 包括Cullin2, SOCS-1 (Suppressor of cytokine signaling 1) 及其他相关因子(李佩佩, 2009; Materia et al, 2012)。另外, COMMD 蛋白可以与许多其他蛋白发生相互作用, 如XIAP (X-linked inhibitor-of-apoptosis protein)、ATP7B (P-type ATPase) (Burstein et al, 2004; de Bie et al, 2005)等, 尚未有报道证明这与COMM结构域有直接关系。然而, COMMD蛋白的氨基末端区域可变度很高, 这可能与COMMD 蛋白的多功能性密切相关(Sommerhalter et al, 2007)。就目前的研究而言, COMMD 蛋白家族成员广泛存在于脊椎动物中, 并在哺乳动物甚至鱼类中高度保守, 而令人惊奇的是, COMMD家族的所有10个成员在原生生物盘基网柄菌 Dictyostelium discoideum中也全部存在(Li et al, 2009)。
COMMD1是最早被发现、目前研究最为透彻的COMMD家族成员之一。Commd1最初作为鼠的一个烙印基因U2af1-rs1的邻近基因而被发现, 因此也被命名为Murr1 (mouse U2af1-rs1 region 1) (Nabetani et al, 1997)。Klomp 等(2003)通过Western印记发现, Commd1基因的mRNA在检测的13种鼠源组织中广泛表达, 其中, 在肾、脾、结肠、肝等4种组织中表达量最高, 而在肌肉和胰腺中表达量最低, 几乎检测不到。细胞分级分离法和间接免疫荧光法表明, COMMD1分布在整个细胞内, 主要在细胞质表达, 少量在细胞核, 未出现在线粒体和溶酶体中(Klomp et al, 2003; Burstein et al, 2004)。越来越多的证据显示, COMMD1是一种多功能蛋白, 具有参与调控铜、钠离子的内稳态, 抑制NF-κB和HIF-1转录因子的活性等功能(Burstein et al, 2005; Maine et al, 2007)。
尽管COMMD1的研究取得了一定进展, 但成果也仅限于人类、小鼠等模式生物, 其参与各种生物学过程的机制尚未完全明确。目前在软体动物中还没有Commd1基因被克隆, 更鲜有关于其功能研究的报道。近年来, 随着基因组测序的完成, 太平洋牡蛎、光滑双脐螺、加州海兔的Commd1同源序列陆续被提交至美国国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 数据库, 但却没有功能研究相关的实验证据。香港牡蛎是华南沿海重要的经济贝类, 其生存的河口地区盐度波动极大(肖莞生 等, 2010), 已经演化出完善而有效的适应能力, 是研究亚热带河口广盐性无脊椎动物耐受机制的理想材料。为初步探究香港牡蛎广盐适应性的分子和调控机制, 本研究通过RACE (rapid amplification of cDNA ends) 技术首次克隆了香港牡蛎ChCommd1基因cDNA全长序列, 对其蛋白序列进行了同源性和系统进化树分析, 并采用荧光定量PCR的方法测定了其在各胚胎发育时期和成体组织中的相对表达量, 同时研究其在香港牡蛎盐度胁迫过程中的表达变化。本研究结果为深入研究该基因在香港牡蛎及其他广盐性软体动物中的作用机制提供了重要依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验所用香港牡蛎成贝采自湛江市东海岛养殖场, 二龄, 平均壳高为90mm。将牡蛎冲洗干净后, 暂养于实验室水族箱中, 人工配制海水盐度为24‰, 温度约为25℃, 持续充气以保持供氧充足, 暂养一周, 期间每天投喂适量海藻粉两次, 方法参见(Xiang et al, 2015)。一周后, 将5只健康的牡蛎解剖, 分别取鳃、外套膜、血淋巴、闭壳肌、消化腺、触唇、心脏、性腺(尚未发育成熟的性腺区组织)等8种组织, 采用预冷的2×PBS洗涤3次, 加入TRIZOL (Invitrogen)匀浆, 立刻冻存于液氮中进行短期保存, 然后置于-80℃冰箱中, 用于RNA的提取。幼虫样品也采自湛江市东海岛养殖场, 通过显微镜观察确定其发育时期后, 在相应的时间点取样。

1.2 总RNA的提取及cDNA第一链的合成

将取得的样品加入适量TRIZOL充分匀浆, 并按照说明书进行总RNA的提取, 分别用分光光度计NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) 与1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量及完整性。随后, 使用反转录试剂盒PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa) 合成cDNA模板。该过程由两个反应组成: 基因组DNA消除反应和反转录反应。第一个反应体系为: 5×gDNA Eraser Buffer, 2μL; gDNA Eraser, 1μL; total RNA, 1μg; 用RNase Free dH2O补齐至10μL; 42℃保温2min。第二个反应体系为: 上步反应液, 10μL; 5×PrimeScript Buffer 2, 4μL; PrimeScript RT Enzyme Mix I, 1μL; RT Primer Mix, 1μL; RNase Free dH2O, 4μL; 37℃保温15min; 85℃, 5s。将反应产物置于-20℃, 用于下一步的荧光定量PCR反应。

1.3 全长cDNA的克隆与鉴定

通过搜索香港牡蛎血淋巴cDNA文库, 发掘一个与太平洋牡蛎Commd1基因高度相似的EST序列。 根据该EST序列,分别设计5′ RACE特异性引物 (ChCommd1-R1, ChCommd1-R2) 和3′ RACE特异性引物 (ChCommd1-F1, ChCommd1-F2) (表1)。用5′ RACE特异性引物和通用引物进行巢氏PCR扩增5′末端, 用3′ RACE特异性引物和通用引物进行巢氏PCR扩增3′末端; 利用带有与EST序列重叠的RACE产物设计引物 (ChCommd1-F3/ChCommd1-R3) (表1), 进行cDNA全长序列的扩增。PCR程序设为: 95℃, 50s; 55℃, 50s; 72℃, 1min; 35个循环。通过1.0%琼脂糖凝胶电泳后将PCR产物的目的条带进行切胶回收, 并将胶回收产物进行连接和转化以及菌株培养鉴定, 送至华大基因进行测序。

1.4 生物信息学分析

香港牡蛎Commd1开放阅读框的预测使用ORF Finder (open reading frame finder) (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder/); 蛋白分子量与等电点的预测使用Compute pI/Mw工具 (http://web.expasy.org/ compute_pi/); 通过BLAST工具搜索蛋白质数据库获得COMMD1同源蛋白序列。用BioEdit软件对香港牡蛎COMMD1与其他物种的COMMD1氨基酸序列进行多序列比对, 采用MAGE 5.0软件中的最大似然法 (maximum likelihood) 构建系统进化树, 采用bootstrap1000个循环检验拓扑结构的置信度。

1.5 盐度胁迫实验

根据Meng 等(2013)的实验方法, 设计一个高盐 (42‰) 实验组, 一个低盐 (4‰) 实验组和一个正常盐度 (24‰) 对照组, 用盐度计来校准配制海水的盐度; 随机挑取暂养一周的健康成贝, 每组各放入55只, 养殖条件见1.1。实验期间, 分别于0、6、12、24、36、48、72、96、120h取样, 每个时间点随机选择5只牡蛎, 每只在相同位置剪取适量鳃组织并用注射器吸取1mL血淋巴, 单个提取RNA样品并进行反转录, 定量实验中, 从中随机选取3个样品作为实验重复。

1.6 实时荧光定量PCR检测

根据已知的ChCommd1序列设计定量引物 (ChCommd1-F4/ChCommd1-R4) (表1), 扩增片段为190bp; 幼虫时期的内参基因使用EF1α (表1), 成贝时期的内参基因使用GAPDH (表1), 这两对引物来自文献Qu 等(2015)。实验采用Light-Cycler 480II System (Roche) 进行。反应体系如下: 2×SYBR Green PCR Master Mix (Roche), 10μL; 10μmol·L-1正向引物 (F), 1μL; 10μmol·L-1反向引物 (R), 1μL; 稀释15倍的cDNA, 1μL; 灭菌水补足到20μL。反应条件: 95℃, 5min, 1个循环; 95℃, 10s; 55℃, 10s; 72℃, 20s, 45个循环。
Tab. 1 Sequences of designed primers used in this study

表1 引物信息

名称 序列 (5'-3') 用途
ChCommd1-R1 TTGCTGCCTCTCTCCTCTTCATTTG 5'RACE
ChCommd1-R2 ACATCTCTTCAGTAGTGTTGCGTAA
ChCommd1-F1 CGTGTTACAAAATATGAAAGACATT 3'RACE
ChCommd1-F2 GTGCCATAGTTGAACTCCAAATAGA
ChCommd1-F3 GAAAACATGACAAACAAAATGG ORF扩增
ChCommd1-R3 TGAGTACGGGAATATGATACAA
ChCommd1-F4 AAGCCATTGCTTACAGAAAGTT 荧光定量PCR
ChCommd1-R4 TCAGGGTTTTCTATTTGGAGTT
GAPDH- F GGATTGGCGTGGTGGTAGAG 内参基因
GAPDH- R GTATGATGCCCCTTTGTTGAGTC
EF1α-F CGGGATCCATGTATAGTCGGGAGA 内参基因
EF1α-R CCCAAGCTTTCACAGAGAAATCAA

注: F表示正向引物, R表示反向引物

1.7 数据分析

每个时间点做3个重复。运用2-ΔΔCt法计算ChCommd1基因在不同组织和不同胚胎发育时期的相对表达量, 使用SPSS 19.0软件对实验组和对照组的表达量进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 ChCommd1基因的序列分析

从香港牡蛎血淋巴cDNA文库中搜索到ChCommd1 EST序列, 设计引物克隆并测序, 获得ChCommd1全长cDNA序列, cDNA序列和预测的氨基酸序列见图1。该序列含有18bp的5'-UTR, 564bp的ORF和259bp的3'-UTR。该ORF编码一个含187个氨基酸, 分子量为21.79kDa, 等电点为5.21的蛋白。另外, 该蛋白具有一个保守的蛋白激酶C (PKC) 磷酸化位点S120WR122。
Fig. 1 Nucleotide and amino acid sequences of ChCommd1

图1 ChCommd1 全长cDNA核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
起始密码子 (ATG) 和终止密码子 (TAA) 用细线方框标出; 加尾信号 (aataaa) 用下划线标出; 保守的蛋白激酶C磷酸化位点 (SWR)用黑体和阴影表示; 用*表示终止密码子

2.2 ChCommd1基因系统进化分析

经多重比较后发现, 香港牡蛎COMMD1与太平洋牡蛎的氨基酸序列一致性最高(图2), 达到97.3%; 与光滑双脐螺、加州海兔的COMMD1的氨基酸序列一致性分别为55.1%和53.2%。经系统进化树分析显示, 香港牡蛎COMMD1蛋白与人Homo sapiens、斑马鱼Danio rerio的COMMD1聚为一支(图3)。上述结果表明, 香港牡蛎COMMD1是软体动物COMMD1家族的一个成员, 且在进化过程中非常保守。
Fig. 2 Multiple alignment of the putative amino acid sequence of ChCommd1 with its homologues in other organisms

图2 香港牡蛎与其他物种COMMD1氨基酸序列的多重比对
彩色阴影部分表示相同部分, “-”代表氨基酸缺失; *表示保守的蛋白激酶C磷酸化位点(SWR); GenBank序列号 (NCBI): Homo sapiens (NP_689729.1); Mus musculus (NP_653097.2); Canis lupus familiaris (AAK98638.1); Alligator sinensis (XP_006016809.1); Danio rerio (NP_001038730.1); Oryzias latipes (XP_004065718.1); Limulus polyphemus (XP_013777807.1); Aplysia californica (XP_005112903.2); Biomphalaria glabrata (XP_013076546.1); Crassostrea gigas (XP_011437950.1)

Fig. 3 Maximum-likelihood phylogenetic tree of ChCommd1 amino acid sequences

图3 基于ML法构建的ChCOMMD1系统进化树

2.3 ChCommd1基因的时空表达分析

2.3.1 幼虫时期ChCommd1基因的表达分析
本实验检测了香港牡蛎受精卵、二细胞、四细胞、囊胚、原肠胚、担轮幼虫和D形幼虫等7个胚胎发育时期的样品。在原肠胚之前的几个时期, ChCommd1的表达量一直比较低, 其中在四细胞时间为最低, 其Ct值为30.18, 但从该时期逐渐上升, 最终在担轮幼虫时期达到峰值, 为受精卵时期的7.3倍, 此后, 在D形幼虫时期迅速下降至受精卵时期的1.3倍(图4)。
Fig. 4 Expression profiles of ChCommd1 during different stages of oyster’s embryonic and larval development

图4 ChCommd1在不同胚胎发育时期的表达模式
数据是3个重复的平均值±标准差, 各胚胎发育时期的表达量均以受精卵为比较的倍数表示。不同的小写字母表示差异显著 (P<0.05)

2.3.2 成体时期ChCommd1基因的表达分析
本实验检测的样品包括鳃、外套膜、血淋巴、闭壳肌、消化腺、触唇、心脏、性腺等八种成体组织。ChCommd1基因在以上8种组织中均有表达, 其中, 在外套膜中表达量最低, 在血淋巴中表达量最高, 约为前者表达量的12.4倍(图5)。
Fig. 5 Expression profiles of ChCommd1 in different adult tissues

图5 ChCommd1在成贝不同组织中的表达模式
数据是3个重复的平均值±标准差, 各成体组织的表达量均以外套膜为比较的倍数表示。不同的小写字母表示差异显著 (P<0.05)

2.4 ChCommd1基因在盐度胁迫下的表达分析

通过实时荧光定量PCR, 检测了盐度胁迫下香港牡蛎Commd1基因在鳃组织中的时空表达模式。在高盐刺激后, ChCommd1基因的表达量迅速上升, 在24h达到一个峰值, 约为对照组 (0h) 的7.0倍, 此后呈现波动变化, 但表达量一直处于较高水平, 并于96h达到第二个峰值, 约为对照组的7.4倍; 在低盐刺激后, ChCommd1基因的表达量变化更为剧烈,不仅在12h快速达到峰值, 而且此峰值更大, 为对照组的11.7倍, 12h后表达量持续下降, 在36h降至最低点, 与对照组的表达量基本持平, 而后, 表达量再度上升, 并维持一个较高的表达水平(图6)。
Fig. 6 Expression profiles of ChCommd1 in gill tissues under high salinity stress and low salinity stress

图6 高盐和低盐胁迫下ChCommd1在腮组织中的表达模式
数据是3个重复的平均值±标准差, 盐度胁迫下不同时间点的表达量均以对照 (0h) 为比较的倍数表示。*代表与对照差异显著 (P<0.05), **代表与对照差异极显著 (P<0.01)

本研究也检测了盐度胁迫下香港牡蛎Commd1基因在血淋巴中的时空表达模式。在高盐刺激后, ChCommd1基因的表达量逐渐上升, 于12h达到对照组的2.3倍, 并且在72h和96h仍保持较高水平的表达; 在低盐刺激后, ChCommd1基因的表达量在6h略低于对照组, 但在12h时迅速达到峰值, 约为对照组的6.1倍, 其表达量随时间逐渐下降且保持一个相对稳定的水平(图7)。
Fig. 7 Expression profiles of ChCommd1 in hemocytes under high salinity stress and low salinity stress

图7 高盐和低盐胁迫下ChCommd1在血淋巴中的表达模式
数据是3个重复的平均值±标准差, 盐度胁迫下不同时间点的表达量均以对照 (0h) 为比较的倍数表示。*代表与对照差异显著 (P<0.05), **代表与对照差异极显著 (P<0.01)

3 讨论

作为一个多功能蛋白, COMMD1参与许多生物学过程, 包括钠转运、铜代谢以及转录因子NF-κB和HIF-1的调节等(de Bie et al, 2005), 因此, 本研究首次从香港牡蛎中克隆出Commd1基因全长cDNA序列。同源性比较和系统进化分析表明, ChCommd1在从无脊椎动物到脊椎动物不同物种的进化上极为保守, 与太平洋牡蛎、光滑双脐螺、加州海兔具有较高的同源性, 并与斑马鱼COMMD1聚为一枝, 由此推测ChCommd1是软体动物Commd1家族的一个成员。实时荧光定量PCR结果显示, ChCommd1基因在香港牡蛎各胚胎发育时期和成体组织中均有分布, 而且, 在盐度刺激后, 其在鳃和血淋巴中的表达量均明显增加。
从无脊椎动物到高等脊椎动物, COMMD1是一种进化非常保守的蛋白。本研究克隆的香港牡蛎Commd1基因编码187个氨基酸, 预测分子量为21.79kDa, 这与高等脊椎动物的报道非常相似, 如人COMMD1含有190个氨基酸, 分子量为21.18kDa; 鼠COMMD1含有188个氨基酸, 分子量为21.00kDa (Van de Sluis et al, 2002)。另外, 通过序列比对, 本研究预测了该蛋白的一个PKC磷酸化位点S120WR122, 此位点在人、犬、鼠等物种的同源基因中也高度保守。多序列比对及系统进化树分析显示, 香港牡蛎COMMD1在氨基酸序列上也非常保守, 且为软体动物COMMD蛋白家族的一个成员, 但其功能上的保守性需要进一步的实验验证。
序列分析证实, Commd1广泛存在于各种多细胞生物体中, 包括原生动物、软体动物、脊索动物、鱼类、爬行动物、哺乳动物等(Maine et al, 2007)。但是, 对于Commd1的功能研究几乎没有涉及低等无脊椎动物, 而仅限于少数高等哺乳动物。例如, Commd1基因的mRNA在人体不同组织中普遍表达, 其中在肝组织中表达量最高, 其次是心、肾、骨骼肌和胎盘, 而在脑、甲状腺、肺、脾等组织中几乎检测不到(Klomp et al, 2003)。Commd1基因缺失的小鼠胚胎仅能存活9.5至10.5天, 研究表明, 这可能是由Commd1参与的多个信号通路异常导致胎盘发育畸形所造成的(Van de Sluis et al, 2007)。本研究显示, ChCommd1基因在香港牡蛎各胚胎发育时期广泛表达, 这意味着ChCommd1基因在香港牡蛎的胚胎发育过程中扮演着重要的角色。其中, 在担轮幼虫时期前后, ChCommd1表达量最高, 这可能与牡蛎在这个时期生理上和形态上发生的转变密切相关(Yang et al, 2014)。
牡蛎生活的潮间带, 盐度波动极大, 然而牡蛎已进化出很多调节渗透压的特殊机制以适应盐度的改变。其中, 3种盐度胁迫效应因子(离子通道蛋白、水通道蛋白、自由氨基酸)的功能机制已被广泛研究(Meng et al, 2013)。为了揭示香港牡蛎Commd1在香港牡蛎渗透压调节体系中的作用机制, 本文进一步检测了鳃和血淋巴两种组织中ChCommd1基因在高盐和低盐两种刺激下的表达量, 结果发现, 两种组织中, 该基因的表达在盐度胁迫后均明显增加。大量证据表明, 海洋软体动物能够在很多方面响应盐度胁迫, 包括在RNA和蛋白质水平的可逆变化、多种酶不同分子构型的相互转变以及离子含量和细胞体积的调节等(Pierce et al, 1981; Berger et al, 1997; Tirard et al, 1997)。另外, 有文献报道COMMD1蛋白与离子转运密切相关, 比如可通过与上皮钠离子通道 (epithelial Na+ channel, ENaC)、钠钾氯离子共转运蛋白 (Na+-K+-2Cl- cotransporter, NKCC1)、囊性纤维化跨膜调节因子 (cystic fibrosis transmembrane regulator, CFTR) 的相互作用进而参与离子转运的调节(Ke et al, 2010; Drévillon et al, 2011; Smith et al, 2013)。ChCommd1能够对高盐和低盐两种胁迫积极响应, 这可能通过调节离子转运来完成, 但是详细的调节机制需要进一步探究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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