Orginal Article

Effect of aluminum on the growth and nitrogen fixation of a marine nitrogen-fixing cyanobacterium: Crocosphaera watsonii

  • LIU Jiaxing , 1, 2, 3 ,
  • ZHOU Linbin 1, 2 ,
  • KE Zhixin 1, 2 ,
  • LI Gang 1, 2 ,
  • SHI Rongjun 1, 2, 3 ,
  • TAN Yehui , 1, 2
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  • 1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Corresponding author: TAN Yehui. E-mail:

Received date: 2016-07-25

  Request revised date: 2016-08-31

  Online published: 2017-04-06

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Abstract

Although a large amount of aluminum enters the ocean through atmospheric dust deposition every year, the effect of aluminum on marine phytoplankton is seldom examined. Few studies focused on the effects of aluminum on marine nitrogen-fixing cyanobacteria, which play important roles in nitrogen and carbon cycling in the ocean. In this study, a unicellular marine nitrogen-fixing cyanobacterium Crocosphaera watsonii grew in Aquil medium without silicate and nitrogen by semi-continuous cultures. We studied the effect of aluminum (0, 0.2, 2 and 20 μmol•L-1) on the growth rate and nitrogen fixation rate of Crocosphaera watsonii by using flow cytometry and 15N isotope tracer method. Results showed that aluminum inhibited the growth and nitrogen fixation of Crocosphaera watsonii. Results also showed that cell size, cellular pigments and photochemical efficiency of photosystem II (Fv/Fm) of Crocosphaera watsonii treated with aluminum were significantly decreased. These results demonstrate that aluminum has an inhibitory effect on the growth and nitrogen fixation of Crocosphaera watsonii under the condition of sufficient phosphate and trace nutrients.

Cite this article

LIU Jiaxing , ZHOU Linbin , KE Zhixin , LI Gang , SHI Rongjun , TAN Yehui . Effect of aluminum on the growth and nitrogen fixation of a marine nitrogen-fixing cyanobacterium: Crocosphaera watsonii[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2017 , 36(2) : 12 -18 . DOI: 10.11978/2016069

铝是地壳中含量最为丰富的金属元素(Taylor, 1964), 主要来源于大气沉降和河流输送(Measures et al, 2000)。在酸性或中性水体中, 一般认为铝对浮游植物具有毒性(Gensemer et al, 1999)。海水中, 尽管有大量的铝可随大气沙尘沉降和河流输入, 然而少有研究报道铝对海洋浮游植物的影响。研究表明, 某些硅藻在生长过程中需要吸收利用铝形成硅质外壳(Gehlen et al, 2003), 而大部分学者认为铝是非营养盐型元素。不多的文献表明, 不同浓度的铝对不同海洋浮游植物有不同影响(Menzel et al, 1963; Stoffyn, 1979; Vrieling et al, 1999; Saçan et al, 2006; Golding et al, 2015; Shi et al, 2015; Zhou et al, 2016)。目前, 尚未有关于铝对海洋固氮生物生长影响的报道。
固氮生物可以把氮气还原为生物可利用的氮, 为初级生产者提供新氮以支持初级生产, 从而在全球碳氮循环中发挥重要作用(Karl et al, 2002)。固氮生物一般分为丝状蓝藻、单细胞蓝藻、共生蓝藻和异养细菌, 主要分布在寡营养的热带亚热带海域(Sohm et al, 2011)。研究表明, 单细胞固氮蓝藻丰度和固氮速率不容忽视, 其在局部海域的固氮量甚至超过束毛藻Trichodesmium (Moisander et al, 2010; Zehr, 2011; Lee Chen et al, 2014)。Crocosphaera watsonii属于B类群, 其生长速率较快且可在实验室培养, 是研究海洋固氮生物的重要模式种之一。
本文利用流式细胞技术和15N同位素示踪法, 研究铝对Crocosphaera watsonii生长和固氮作用的影响, 初步探讨铝对海洋固氮生物影响的机理, 为揭示铝对自然海水中固氮生物生长和固氮的影响提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料及培养条件

实验用藻种Crocosphaera watsonii (WH0003)由美国南加利福尼亚大学(University of Southern California)提供。培养条件为: 光暗周期为12h/12h, 温度为28℃, 光照强度为120μmol photons·m-2·s-1。采用无氮和硅酸盐的Aquil培养基培养(Sunda et al, 2005), 具体如下: 人工海水(NaCl 4.2×10-1mol·L-1, Na2SO4 2.88×10-2mol·L-1, KCl 9.39×10-3mol·L-1, NaHCO3 2.38×10-3mol·L-1, KBr 8.4×10-4mol·L-1, H3BO3 4.85× 10-5mol·L-1, NaF 7.15×10-5mol·L-1, MgCl2·6H2O 5.46 × 10-2mol·L-1, CaCl2·2H2O 1.05×10-2mol·L-1, SrCl2·6H2O 6.38×10-5mol·L-1), 金属元素(EDTA·2H2O 1×10-4mol·L-1, FeCl3·6H2O 1×10-6mol·L-1, MnCl2·4H2O 1.21×10-7mol·L-1, NaMoO4·2H2O 1×10-7mol·L-1, ZnSO4·7H2O 7.97× 10-8mol·L-1, CoCl2·6H2O 5.03×10-8mol·L-1), 维生素(B1 2.96×10-7mol·L-1, B12 3.69×10-10mol·L-1, 生物素2.05× 10-9mol·L-1), NaH2PO4·H2O 1×10-5mol·L-1。培养的人工海水预先用0.45μm的聚碳酸酯滤膜(millipore)过滤, 然后用微波灭菌。培养容器为盐酸(2.5mol·L-1)浸泡1周后用超纯水清洗干净的0.5L的聚碳酸酯(nalgene)瓶。

1.2 实验设计

实验设置0、0.2、2和20μmol·L-1 4个铝浓度梯度, 其中0.2μmol·L-1代表自然海水中的最大铝浓度, 2μmol·L-1代表河口区域最大铝浓度, 20μmol·L-1代表海水中最大铝溶解平衡浓度(de Jong et al, 2007; Brown et al, 2009; Golding et al, 2015), 每个梯度设3个平行样。在灭菌的培养基中添加AlCl3母液(1g·L-1, 99.999%, Sigma-Aldrich, USA)使其达到相应的铝浓度梯度, 放置一夜稳定后接种, 然后进行半连续培养(每3天转接一次), 使初始藻浓度为20×106cell·L-1。为了尽可能让Crocosphaera watsonii对铝适应并保持稳定的生理状态, 因此从第9代开始才开始实验。实验时, 分别在每次接种后第3天测定固氮速率和光系统Ⅱ(PSⅡ)原初光能转化效率(Fv/Fm), 每天于光周期开始后固定时间点(第9小时左右, 此时细胞已经分裂完毕)取2mL藻液, 用1%的甲醛固定后置于-80℃冰箱保存, 用于测定Crocosphaera watsonii生长速率和细胞内光合色素荧光。其中生长速率、固氮速率、Fv/Fm和细胞内光合色素荧光为第9~11代的平均值。

1.3 固氮速率测定

固氮速率测定的具体步骤如下(Montoya et al, 1996; Mohr et al, 2010a): 取30mL对数生长期藻液于40mL的聚碳酸酯瓶, 加入10mL配置好的含有15N2(99atom%15N; Aladdin)的人工海水母液(100mL海水中含有1mL 15N2), 轻轻晃动混匀, 放入光照培养箱培养24h, 设3个重复。用GF/F玻璃纤维滤膜(0.7μm, Whatman, 预先450℃灼烧4h)过滤40mL培养前后藻液, 收集滤膜放入-20℃冰箱保存, 以测定培养前后Crocosphaera watsonii 15N的丰度。样品测定前, 将滤膜置于60℃烘箱中烘烤24h至干燥, 用锡箔包裹烘干的滤膜, 通过元素分析仪-同位素比值质谱仪联机(Elemental Analyzer-Isotope Ratio Mass Spectrometer, Thermo Scientific)测定样品中的氮含量及其同位素组成。固氮速率计算方法参照Montoya 等(1996)

1.4 生长速率、细胞内光合色素荧光值和Fv/Fm测定

用流式细胞仪(Becton Dickinson, Accuri™ C6)进行细胞计数, 同时以FL3荧光和FL2荧光分别代表细胞内叶绿素a浓度和藻胆蛋白浓度(Mohr et al, 2010b); FSC和SSC分别代表平均细胞大小和细胞内含物或细胞复杂度(Tzur et al, 2011)。
生长速率(μ)计算参考公式为: μ=(lnN1–lnN0)/ (T1T0), 式中μ为生长速率(d-1), N1N0分别是T1时刻和T0时刻的细胞密度(cells·L-1), 本实验中T0T1分别为藻液接种后的第1天和第3天。
Fv/Fm测定采用二氯苯基二甲脲(DCMU)法(Samuelsson et al, 1977)。简单而言, 取10mL处于对数期的藻液于15mL的玻璃管, 混合均匀, 暗室处理30min, 随后用Tunner-Design10荧光计测取藻液叶绿素a荧光(F0), 然后加入DCMU使其终浓度为10μmol·L-1, 混匀后立即测取藻液叶绿素a荧光(Fm), Fv/Fm根据(Fm-F0)/Fm计算得出。

1.5 数据分析

实验数据以“平均值±标准误”(MEAN±SE)表示(n=3)。用SPSS 18.0进行单因素方差分析(One- Way ANOVA), p<0.05认为组间具有显著性差异。

2 结果

2.1 铝对Crocosphaera watsonii生长速率的影响

对照组Crocosphaera watsonii的生长速率为0.63±0.01d-1, 0.2μmol·L-1、2μmol·L-1和20μmol·L-1铝处理组的生长速率分别为0.56±0.01d-1、0.53± 0.02d-1和0.50±0.04d-1, 3个铝处理组的生长速率都明显低于对照组(p<0.05), 且随着铝浓度由0.2μmol·L-1增加至20μmol·L-1, Crocosphaera watsonii的生长速率降低更为明显(图1)。
Fig. 1 Effect of aluminium on the growth rate of Crocosphaera watsonii. Different letters represent statistically significant differences at p < 0.05

图1 铝对Crocosphaera watsonii生长速率的影响
不同字母代表不同铝处理组组间在0.05水平上具有显著性差异, 下同

2.2 铝对Crocosphaera watsonii固氮速率的影响

0.2、2和20μmol·L-1铝处理组平均单个细胞的固氮速率分别为1.06±0.04、1.07±0.04和1.27±0.09fmol N·cell-1·h-1, 3个铝处理组的固氮速率都显著低于对照组藻细胞的固氮速率1.72±0.25fmol N·cell-1·h-1 (p<0.05; 图2)。
Fig. 2 Effect of aluminium on the nitrogen fixation rate of Crocosphaera watsonii

图2 铝对Crocosphaera watsonii固氮速率的影响

2.3 铝对Crocosphaera watsoniiFv/Fm比值的影响

对照组Crocosphaera watsoniiFv/Fm为0.43± 0.02, 0.2、2和20μmol·L-1铝处理组的Fv/Fm分别为0.34±0.01、0.30±0.02和0.28±0.01, 3个铝处理组的Fv/Fm都明显低于对照组(p<0.05), 且随着铝浓度由0.2μmol·L-1增加至20μmol·L-1, Fv/Fm值逐渐降低(图3)。
Fig. 3 Effect of aluminium on Fv/Fm of Crocosphaera watsonii

图3 铝对Crocosphaera watsonii Fv/Fm比值的影响

2.4 铝对Crocosphaera watsonii细胞内叶绿素a、藻胆蛋白、细胞大小和细胞内含物的影响

3个铝处理组细胞FL3荧光显著低于对照组, 且随着铝浓度增加而显著降低(p<0.05; 图4a)。
Fig. 4 Effect of aluminium on FL3 (a), FL2 (b), FSC (c), and SSC fluorescence (d) of Crocosphaera watsonii

图4 铝处理后Crocosphaera watsonii细胞FL3(a)、FL2(b)、FSC(c)和SSC(d)荧光的变化

就细胞FL2荧光而言, 0.2μmol·L-1铝处理组与对照组相差不明显, 而2μmol·L-1和20μmol·L-1铝处理组显著低于对照组, 且20μmol·L-1处理组最低(p<0.05; 图4b)。
就平均细胞体积(FSC)和细胞内含物或细胞复杂度(SSC)而言, 3个铝处理组显著小于对照组(p< 0.05), 其中0.2μmol·L-1和2μmol·L-1两个铝处理组相差不大, 20μmol·L-1铝处理组稍高于0.2μmol·L-1和2μmol·L-1处理组(图4c、d)。

3 讨论

MINTEQ模型分析表明, 铝在本研究培养基中主要以Al(OH)3和Al(OH)4-的形式存在, 且后者占90%以上, 实验培养过程中pH在8.01~8.51之间, 并不会改变铝的形态和比例(数据未显示)。尽管在弱酸性或中性水体中普遍认为Al3+对浮游植物具有毒性, 而对海水中占优势的Al(OH) 4-对浮游植物的影响却知之甚少(Gensemer et al, 1999)。本研究中, 3个铝处理组Crocosphaera watsonii生长速率和固氮速率明显受到抑制(图1图2), 细胞大小、光合色素含量和Fv/Fm都显著降低(图3图4), 表明在营养充足条件下铝对Crocosphaera watsonii表现出毒性。对于实验中出现的20μmol·L-1铝处理组固氮速率、细胞FSC和SSC信号稍高于0.2μmol·L-1和2μmol·L-1处理组的现象, 可能是由于高浓度铝处理后细胞的生理特征产生明显的差异和不稳定性所致。碱性环境中, 铝对浮游植物的影响可能与浮游植物种类有关, 如在ASP-2培养基下, 低浓度铝(<0.04μmol·L-1)刺激硅藻Skeletonema costatum生长(Stoffyn, 1979); 在f/2培养基下, 0.1~10μmol·L-1的铝促进硅藻Navicula salinarum的生长, 而对硅藻Thalassiosira weissflogii生长影响不大(Vrieling et al, 1999), 0.2~20μmol·L-1铝促进蓝藻聚球藻(Synechococcus)生长(Shi et al, 2015); Golding 等 (2015)和Gillmore 等 (2016)的研究也表明海洋浮游植物对同浓度铝的耐受性差异较大。同时, 铝对浮游植物的影响可能与铝浓度有关, 如在f/2培养基下, 18μmol·L-1铝促进绿藻Dunaliella.tertiolecta生长, 而大于148μmol·L-1则抑制其生长(Saçan et al, 2006); 另外, 铝对浮游植物的影响可能还与营养状态有关, 如在f/2培养基下培养, 0.1~10μmol·L-1的铝抑制硅藻Thalassiosira weissflogii生长(Vrieling et al, 1999); 而在磷限制情况下, 0.04~ 20μmol·L-1铝却促进了硅藻Thalassiosira weissflogii生长(Zhou et al, 2016)。尽管已有不多的文献报道了铝对海洋浮游植物的影响, 但铝对蓝藻影响的报道却少之又少, 我们的研究可能是铝对海洋固氮蓝藻影响的首次报道, 为揭示铝对自然海水中固氮生物生长和固氮的影响提供研究基础。
本研究中, 铝使Crocosphaera watsoniiFv/Fm显著降低(图3), 表明铝处理后Crocosphaera watsonii受到胁迫。Fv/Fm是PSⅡ的最大光化学效率, 反映所有PSⅡ反应中心均处于开放态时的量子产量, 是研究各种胁迫环境对光合作用影响的重要指标(Parkhill et al, 2001)。当藻体受到胁迫时, Fv/Fm显著下降, 如Hg2+、Cu2+和Cd2+等重金属可通过影响叶绿体膜系统及PSⅡ电子传递(母波 等, 2007)、影响PSⅡ原初光化学反应的电子供体和受体位点(Küpper et al, 2002)以及阻碍捕光色素复合体捕获光能(Baumann et al, 2009), 最终使多种藻类Fv/Fm降低。如本研究中铝处理组细胞内颗粒度降低(图4d), 可能与铝在细胞亚显微结构水平上受到的胁迫相关。研究表明, 铝对Dunaliella tertiolecta的毒性作用可表现在细胞亚显微结构上, 如吸附或结合在细胞表面裂解细胞膜, 扰乱类囊体膜, 富集多磷酸盐小体和液泡(Saçan et al, 2007)。
同时, 本研究中铝处理组Crocosphaera watsonii细胞内两种光合色素(叶绿素a和藻胆蛋白)含量降低(图4a, 4b), 表明铝可能通过影响Crocosphaera watsonii光合作用电子传递, 降低PSⅡ的量子产量进而影响光合作用。藻胆蛋白是构成藻胆体的主要成分, 藻胆蛋白能高效率地捕获光能并传递给PSⅡ, 其参与光能的吸收和传递, 是重金属离子作用的重要位点之一(Glazer, 1982)。如Co、Cu和Zn可抑制藻胆体向叶绿素的光能传递, 促进藻胆蛋白解聚作用(李建宏 等, 1997); Ni可抑制铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa生长, 且使叶绿素和藻胆蛋白变性, 抑制藻细胞的吸光能力(刘洁 等, 2005)。本研究中, 藻胆体蛋白荧光降低可能表明铝影响藻胆体含量, 叶绿素荧光峰的减弱可能是由于藻胆蛋白荧光减弱而使传递给叶绿素的光能减少所致(Lu et al, 1985)。同时, 最近的蛋白质组学数据表明, 光合作用途径是铝作用于海洋浮游植物的一个重要靶点, 铝能降低类囊体膜上的电子传递速率(Xie et al, 2015)。
本研究结果与Xie 等 (2015)的一致, 后者研究表明铝使Phaeodactylum tricornutum的生长速率和Fv/Fm降低, 同时铝使其细胞内丙二醛和超氧化物歧化酶含量增加, 活性氧清除蛋白表达增加, 说明铝处理后浮游植物受到生理胁迫。而本研究结果与其他结果不一致, 如铝(0.2~20μmol·L-1)促进聚球藻生长, 并且使其细胞内其藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和叶绿素a的含量增加(Shi et al, 2015; 史荣君 等, 2016); 在磷限制情况下, 铝使Thalassiosira weissflogii生长速率和细胞内叶绿素a增加(Zhou et al, 2016)。有研究表明铝对浮游植物的促进作用可能是通过促进其细胞内光合色素的合成, 使PSⅡ的最大光能转化效率增大, 进而使其生长速率增加(Shi et al, 2015)。而本研究中, 铝可能通过使细胞内光合色素含量降低影响其光合作用, 进而最终影响其生长。这进一步说明铝对不同海洋浮游植物生长的影响存在显著差异。
本研究发现铝处理组Crocosphaera watsonii固氮速率降低(图2)且细胞体积变小(图4c), 可能表明铝处理组受到营养胁迫。研究表明磷和铁是固氮生物生长的限制性营养因子, 固氮生物缺乏磷和铁直接导致固氮速率下降(Sohm et al, 2011)。同时, 磷或铁等限制性元素缺乏也会使细胞体积减小(Jacq et al, 2014; Garcia et al, 2015), 鉴于实验培养基中磷铁营养较为充足, 推测铝可能使Crocosphaera watsonii吸收利用磷铁等的能力降低。细胞体积变小后, 较高的表面积和体积比有利于所需要营养如磷铁的跨膜吸收(Sunda et al, 2010), 有利于缓解所需营养的限制。如随着细胞体积减小, 磷的吸收速率增加(Garcia et al, 2013); 同时, 体积小的细胞用于生殖的物质能量耗费降低, 进而有利于维持其生长(Garcia et al, 2015)。在酸性环境中, 铝直接或间接影响细胞内磷代谢(Nalewajko et al, 1985; Pettersson et al, 1992; Exley et al, 1993), 也能与铁等阳离子竞争结合位点(Gensemer et al, 1999)。碱性环境中, 铝能够促进Thalassiosira weissflogii对铁的吸收, 而抑制Dunaliella tertiolecta对铁吸收(Santana-Casiano et al, 1997)。尽管铝不影响无机磷在海水中的形态, 但是铝处理后Thalassiosira weissflogii对高浓度无机磷的吸收速率降低(Zhou et al, 2016); 因此我们推测, 铝可能会通过影响Crocosphaera watsonii对磷铁等生长限制性元素的吸收利用, 进而影响其固氮和生长。另外, 本研究中铝对Crocosphaera watsonii生理代谢的影响, 也可能与加富的铝在海水pH条件下极易形成胶体包裹在其表面有关。无疑这需要进一步的实验证实。

4 结论

本文利用流式细胞技术和15N同位素示踪法, 在磷酸盐和各种痕量营养元素充足的条件下, 研究铝(0、0.2、2和20μmol·L-1)对Crocosphaera watsonii生长和固氮作用等生理过程的影响。数据表明, 3个铝处理组Crocosphaera watsonii细胞大小、光合色素含量和Fv/Fm都显著降低, 生长速率和固氮速率明显受到抑制, 表明在营养充足条件下铝对Crocosphaera watsonii表现出毒性。产生这种现象的机理尚不清楚, 推测铝对Crocosphaera watsonii生长、固氮和光合作用等生理过程的抑制性作用可能与铝对其磷铁等营养的吸收相关。

The authors have declared that no competing interests exist.

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