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Journal of Tropical Oceanography >

2017 , Vol. 36 >Issue 3: 55 - 60

DOI: https://doi.org/10.11978/2016081

Orginal Article

Enantioselective production of (R)-1-phenylethanol by a novel marine microbial carboxylesterase

  • HUANG Jinlong , 1, 2 ,
  • ZHANG Yun 1, 3 ,
  • SUN Aijun 1, 3 ,
  • HU Yunfeng , 1, 3, 4
Expand
  • 1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, Guangdong 510301, China
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
  • 3. Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, Guangdong 510301, China
  • 4. South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center, Guangzhou, Guangdong 510275, China
Corresponding author: HU Yunfeng. E-mail:

Received date: 2016-08-31

  Request revised date: 2016-09-22

  Online published: 2017-06-01

Supported by

Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (XDA11030404)

Guangzhou Science and Technology Plan Projects (201510010012)

National Natural Science Foundation of China (21302199)

Copyright

热带海洋学报编辑部
Fold

Abstract

Deep-sea microbial esterase BSE00077 can efficiently resolve (±)-1-phenylethyl acetate and generate (R)-1- phenylethanol. The optimal working conditions for the enzymatic resolution of (±)-1-phenylethyl acetate by marine microbial esterase BSE00077 were found to be: 50mmol/L (±)-1-phenylethyl acetate, 10% n-heptane (v/v), pH 7.0, 30°C for 2h. After process optimization, desired optically pure product (R)-1-phenylethanol was obtained with an enantiomeric excess of over 99% and a conversion of over 30%. Esterase BSE00077 can also enzymatically resolve some other racemic 1-phenylethyl esters with different chain lengths. We found that the chain lengths could greatly affect the enantiomeric excess of desired product. Esterase BSE00077 is a novel marine microbial esterase with great potential in the asymmetric synthesis of (R)-1-phenylethanol as well as of other chiral chemicals in industry.

Key words： deep-sea microbial esterase; (R)-1-phenylethanol; hydrolysis; kinetic resolution

Cite this article

HUANG Jinlong , ZHANG Yun , SUN Aijun , HU Yunfeng . Enantioselective production of (R)-1-phenylethanol by a novel marine microbial carboxylesterase[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2017 , 36(3) : 55 -60 . DOI: 10.11978/2016081

羧酸酯酶(E.C.3.1.1.1)是一类水解酯, 产生羧酸和醇的水解酶类, 其被广泛用于化合物的拆分与制备有价值的手性分子(Cambou et al, 1984; Tang et al, 2011)。羧酸酯酶通过一系列的生物转化作用, 如水解、酯化和转酯化反应, 来生产高光学纯的手性试剂(Fernández-Álvaro et al, 2010; Bornscheuer, 2014; Fillat et al, 2015)。由于羧酸酯酶在手性化合物的拆分过程中并不需要昂贵的辅酶, 因此作为生物催化剂在工业生产中具有非常高的应用潜力, 吸引大量科学研究人员开发它的应用价值。
手性1-苯乙醇及其衍生物的制备在工业生产中非常重要, 因为光学纯的单体分子是合成许多药物和化学制品的关键中间体。例如, 光学纯的(R)-1-苯乙醇是合成抗肿瘤药物噻吩并嘧啶酮衍生物和芬地林衍生物的手性砌块(Weber et al, 2014)。传统化学合成1-苯乙醇是以金属配合物为催化剂不对称合成, 然而化学催化法费时, 试剂昂贵, 并且在有机相中需要严格控制反应条件, 由此导致一系列污染物产生(Giri et al, 2001)。与化学催化法相比, 生物酶法具有特异性强、反应条件温和、对环境友好等优点。之前有研究报道用甜菜根表皮水解拆分乙酸苏合香酯, (R)-1-苯乙醇的对映体过量值达到83%。Fan等(2011)用Candida antarctica脂肪酶B水解消旋的乙酸苏合香酯, 制备光学纯的(S)-1-苯乙醇。尽管可以利用氧化还原酶催化还原反应的方法制备手性1-苯乙醇, 但是氧化还原酶需要昂贵的辅酶, 如NADH或NADPH (Thörn et al, 2011)。直接水解消旋酯的方式是目前比较认可的简便快速制备手性醇的方法, 工业生产过程中切实可行。
在前期的工作中, 本单位从南中国海海底沉积物中筛选出一株枯草芽孢杆菌Bacillus sp. SCSIO 15029。本实验室并完成了该菌的全基因组测序工作, 从其基因组中扩增出一个酯酶基因(bse00077), 并在大肠杆菌中实现了酯酶BSE00077蛋白的可溶性异源表达。本研究用纯化的酯酶BSE00077水解乙酸苏合香酯, 制备(R)-1-苯乙醇(图1), 最优反应条件下, 转化率可大于30%, 产物(R)-1-苯乙醇纯度可大于99%。实验探讨反应温度、反应pH、有机溶剂、底物浓度、反应时间和不同酰基链长的底物对酯酶拆分的影响。
Fig. 1 Enzymatic kinetic resolution of (±)-1-phenylethyl acetate by esterase BSE00077

图1 酯酶BSE00077拆分乙酸苏合香酯

1 材料方法

1.1 实验材料

酯酶重组菌已由本实验室构建, 并完成酯酶的表达纯化, 酶浓度为1.25mg•mL-1, 特异性酶活为217U•mg-1。消旋乙酸苏合香酯(98%), 丙酸苏合香酯(≥98%), 丁酸苏合香酯(≥98%)和(R)-1-苯乙醇(≥99%)均购于阿拉丁有限公司(上海, 中国), 其他试剂均为分析纯, 购于广州东巨有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 温度和pH对酯酶拆分的影响
本研究采用单因素试验, 优化拆分条件。在0.5mL的反应体系中加入0.4mL 50mmol•L-1磷酸钠缓冲液(pH 8.0), 0.1mL纯酶液, 终浓度为50mmol•L-1乙酸苏合香酯。设定反应的温度范围为25~45℃, 置于转速为200r•min-1的摇床中振荡反应6h。所有试验均重复3次, 取平均值。
反应pH的优化。在0.5mL的反应体系中加入0.4mL 50mmol•L-1磷酸钠缓冲液(pH 6.0~9.0), 0.1mL纯酶液, 终浓度为50mmol•L-1乙酸苏合香酯。置于最适温度(30℃)和转速为200r•min-1的摇床中振荡反应6h。
1.2.2 有机溶剂对酯酶拆分的影响
在0.5mL的反应体系中加入0.35mL 50mmol•L-1磷酸钠缓冲液(pH 7.0), 0.1mL纯酶液, 终浓度为50mmol•L-1乙酸苏合香酯, 以及10% (体积分数)有机溶剂(正己烷, 正庚烷, 正辛烷, 甲苯, 二甲苯, 甲醇和二甲基亚砜)。反应混合液置于最适温度(30℃)和转速为200r•min-1的摇床中振荡反应6h。
1.2.3 底物浓度对酯酶拆分的影响
在0.5mL的反应体系中加入0.35mL 50mmol•L-1磷酸钠缓冲液(pH 7.0), 0.1mL纯酶液, 不同终浓度的乙酸苏合香酯(10、20、50、80、100mmol•L-1), 以及10%正庚烷作为溶剂。反应混合液置于最适温度(30℃)和转速为200r•min-1的摇床中振荡反应6h。
1.2.4 反应时间的优化
在反应瓶中加入3.5mL 50mmol•L-1磷酸钠缓冲液(pH 7.0), 1mL纯酶液, 终浓度为50mmol•L-1乙酸苏合香酯, 以及10% (体积分数)正庚烷。反应混合液置于最适温度(30℃)和转速为200r•min-1的摇床中振荡反应, 在一定时间内取出0.5mL反应液用于气相色谱分析。
1.2.5 不同酰基链长的底物拆分
在0.5mL的反应体系中加入0.35mL 50mmol•L-1磷酸钠缓冲液(pH 7.0), 0.1mL纯酶液, 终浓度为50mmol•L-1乙酸苏合香酯、丙酸苏合香酯或丁酸苏合香酯, 以及10% (体积分数)正庚烷。反应混合液置于最适温度(30℃)和转速为200r•min-1的摇床中振荡反应0.5h, 比较不同底物的拆分速率。
1.2.6 气相色谱分析
以上所有拆分反应均用等体积的乙酸乙酯终止反应, 振荡混匀5min, 并萃取3次, 将有机相合并后加入终浓度为22mmol•L-1的十二烷作为内标, 再加入适量的无水Na2SO4干燥, 即可用于气相分析。
有机相中的底物和产物分析用FULI 9790Ⅱ气相色谱仪, 手性毛细管柱为112-6632 CYCLOSIL-B(长30m×内径0.25mm, 膜厚0.25μm, 安捷伦公司), 载气为氮气, 流速为1.2mL•min-1。色谱柱的升温程序为80℃保持1min, 以15℃•min-1的速度升温至120℃, 保持1min, 再以10℃•min-1的速度升温至200℃。进样器和检测器的温度分别设置为220℃和250℃。产物(R)-1-苯乙醇的对映体过量值(eep)、底物的转化率(c)和对映体比值(E)根据以下公式进行计算(Chen et al, 1982)。
式中: SR和SS分别代表(R)-1-苯乙醇和(S)-1-苯乙醇的峰面积(单位: μV•s); ωR,0和ωS,0分别代表反应前对应构型的底物浓度(单位: mmol• L-1); ωR和ωS分别代表反应后对应构型的底物浓度(单位: mmol•L-1)。

2 结果

2.1 温度和pH对酯酶BSE00077拆分的影响

温度和pH是影响酶拆分的两个重要因素。由表1可看出, 当温度超过30℃时, 产物对映体过量值逐渐下降。尽管在25℃和30℃时, 产物对映体过量值相差不大, 但在30℃时底物的转化率比20℃的高。因此, 以30℃作为优化的反应温度。
Tab. 1 Effects of temperature and pH on kinetic resolution by esterase BSE00077

表1 温度和pH对酯酶BSE00077拆分的影响

温度/℃ 产物对映体过量值/% 底物转化率/% pH 产物对映体过量值/% 底物转化率/%
25 96.17 ± 0.47 37.12 ± 1.32 6 99.50 ± 0 9.20 ± 1.72
30 96.21 ± 0.88 42.51 ± 1.45 7 93.27 ± 1.08 41.64 ± 2.44
35 95.53 ± 0.35 44.54 ± 1.74 8 91.94 ± 0.64 45.32 ± 1.69
40 95.25 ± 0.95 37.28 ± 0.77 9 91.23 ± 0.52 47.10 ± 3.07
45 85.30 ± 0.81 9.96 ± 1.31
与温度的影响不同, 随着pH的升高, 产物对映体过量值也呈逐渐下降的趋势, 而底物转化率却升高(表1)。由于在pH 6.0时底物转化率较低, 仅为9.2%, 因此以pH 7.0作为优化的反应pH。

2.2 有机溶剂对酯酶BSE00077拆分的影响

本研究以极性和非极性溶剂作为反应添加剂, 考察溶剂对酯酶的拆分选择性。由表2可看出, 除了添加甲苯的反应, 产物对映体过量值明显高于对照外, 添加其他溶剂的反应, 产物对映体过量值与对照均无太大差异。而正己烷、正庚烷和正辛烷均有助于提高底物转化率。因此, 以10%正庚烷作用溶剂用于后续的实验优化。
Tab. 2 Effects of organic solvents on kinetic resolution by esterase BSE00077

表2 有机溶剂对酯酶BSE00077拆分的影响

有机溶剂 lg P* 产物对映体过量值/% 底物转化率/% 对映体比值E
对照 94.35 ± 1.05 27.90 ± 0.79 49.38 ± 4.27
二甲基亚砜 -1.35 93.75 ± 0.67 31.76 ± 1.44 47.97 ± 4.38
甲醇 -0.72 93.63 ± 0.45 7.33 ± 1.38 32.80 ± 1.95
甲苯 2.68 >99.00 5.04 ± 0.69 209.65 ± 1.56
二甲苯 3.14 94.14 ± 0.88 14.37 ± 1.05 39.24 ± 3.68
正己烷 3.94 94.49 ± 0.95 31.73 ± 3.41 55.36 ± 6.25
正庚烷 4.47 94.81 ± 0.68 31.72 ± 2.44 58.53 ± 5.12
正辛烷 5.01 94.23 ± 0.79 32.03 ± 1.75 52.77 ± 5.76

注: *: 有机化合物脂水分配系数, 数值参考自www.chemspider.comr

2.3 底物浓度对酯酶BSE00077拆分的影响

底物浓度是影响酶催化进程的另一重要因素, 过高的浓度反过来会抑制酶的反应。为了优化最佳的底物浓度, 分别设置不同的浓度梯度。由图2可看出, 伴随底物浓度升高, 产物对映体过量值由90%缓慢增加到94%, 而底物转化率却呈现下降趋势。当底物浓度超过50mmol•L-1时, 转化率出现急剧下降。
Fig. 2 Effects of substrate concentration on kinetic resolution

图2 底物浓度对酯酶BSE00077拆分的影响

2.4 拆分反应时间的优化

经过以上条件优化之后, 接着进行反应时间的优化, 以确保产物对映体过量值≥99%时的最佳反应时间。从表3可看出, 产物对映体过量值随着反应时间的延长而出现下降的趋势, 在6h之后保持平衡(94%)。而底物转化率先升高后保持平衡(43%)。反应2h时, 产物对映体过量值≥99%, 转化率约为30%。
Tab. 3 Time proceeding of kinetic resolution of (R, S)-1- phenylethanol catalyzed by esterase BSE00077

表3 酯酶BSE00077拆分(R, S)-1-苯乙醇的反应时间进程

时间/h 产物对映体过量值/% 底物转化率/%
0.5 99.19 ± 0.14 23.79 ± 1.03
1 99.12 ± 0.12 25.68 ± 0.92
2 99.03 ± 0.09 30.71 ± 0.67
3 98.14 ± 0.48 36.22 ± 2.31
4 97.00 ± 0.47 40.60 ± 1.94
5 96.45 ± 1.01 42.33 ± 2.04
6 94.48 ± 0.89 43.57 ± 1.87
7 94.53 ± 0.36 43.53 ± 1.44
8 94.43 ± 0.42 43.61 ± 1.37

2.5 酯酶BSE00077拆分不同酰基链长的底物

酯酶BSE00077对不同酰基链长的1-苯乙醇酯都有拆分能力, 对乙酸苏合香酯和丙酸苏合香酯的水解速率几乎一样, 而对丁酸苏合香酯的水解速率最低(表4)。以短链的乙酸苏合香酯为底物时, 产物对映体过量值≥99%, 比另外2个值都高。由此说明酯酶BSE00077对短链的乙酸苏合香酯偏好性高于丙酸苏合香酯和丁酸苏合香酯。
Tab. 4 Enzymatic kinetic resolution of 1-phenylethyl esters with different chain lengths by esterase BSE00077

表4 酯酶BSE00077拆分不同酰基链长的1-苯乙醇酯

底物 反应
时间/h		 起始反应速率/(mmol·L-1·h-1) 产物对映体
过量值/%		 底物转化率/%
乙酸苏合香酯 0.5 23.79 99.19 ± 0.14 23.79 ± 1.03
丙酸苏合香酯 0.5 23.84 90.22 ± 0.51 23.84 ± 1.55
丁酸苏合香酯 0.5 10.40 91.67 ± 0.73 10.40 ± 0.28

3 讨论

酯酶由于具有工业应用的价值, 如在洗涤业、医疗诊断和生物转化等方面都应用广泛, 因而备受关注(Panda et al, 2005; Salameh et al, 2007)。用于工业的酯酶多数来源于微生物, 如真菌和细菌。本研究从一株南海深海枯草芽孢杆菌Bacillus sp. SCSIO 15029中克隆到一个羧酸酯酶基因, 并实现在大肠杆菌中异源表达, 该酯酶能够水解1-苯乙醇酯, 制备高光学纯的(R)-苯乙醇。
通过优化拆分条件发现, 温度和pH都影响酯酶BSE00077的拆分。通常, 适当的升高温度有利于提高酶活, 加快酶促反应(Chang et al, 2010)。酯酶BSE00077在35℃条件下的转化率最高。然而, 在较高温度下, 酯酶BSE00077对异构体的识别却下降, 这可能与酶在较高温度下结构发生轻微的变化有关, 类似的现象也得到了其他研究的实证。Zheng等(2015)研究发现来源于B. amyloliquefaciens WZZ002的酯酶在高于45℃时, 对Boc-L-丙氨酸甲酯的选择性逐渐下降。pH的变化会改变酶活性中心附近的空间构象, 反过来会影响酶的活性和选择性(Tian et al, 2011)。酯酶在pH 8.0和9.0活性较高, 但在这个pH范围内的产物对映体过量值不太理想。而在pH 6.0下, 活性却受到抑制, 转化率较低。
研究表明, 有机溶剂可增加底物的可溶性, 改变酶促反应平衡, 提高酶的选择性(Kitaguchi et al, 1989; Smith et al, 2012)。除了二甲基亚砜、甲醇、甲苯和二甲苯对酶促反应有抑制外, 其他有机溶剂均促进反应, 可能这些有机溶剂直接影响酶的构象, 改变酶反应活性通道, 利于底物与酶的结合。因此, 两相体系成为许多研究酶催化拆分手性分子所考虑的反应体系。以重组全细胞作为催化剂, 在混合正庚烷与水(2:8)的两相体系中, 更容易获得高产率和高对映体过量值的(S)-2,3-二氢-1-丙醇(Zou et al, 2014)。Zheng等(2014)发现50%体积分数的二甲基亚砜对全细胞催化拆分3-氰基-5-甲基己酸乙酯的促进作用最强, 立体选择性E由30增加到80。也有研究者提出, 具有较高脂水分配系数(lgP≥4)的有机溶剂可改善酶促反应(Laane et al, 1987)。正己烷、正庚烷和正辛烷的lgP≥3.94, 在本研究中对酶促反应有轻微的促进作用, 与Laane等(1987)的研究基本相符。
酶的立体选择性与底物的在活性口袋中的空间结构密切相关。通常认为手性分子中的立体中心在α或β位上, 与功能基团相近, 有利于进行酶的生物转化(Blasco et al, 2014)。1-苯乙醇作为立体中心部分, 脂肪酸链作为功能基因, 这些底物的立体中心部分与功能基因间的碳键数一样, 但随着脂肪酸链的延长, 酯酶的立体选择性下降。这可能是因为酯酶BSE00077的活性口袋较小, 增延长肪酸链增加了底物的空间位阻效应, 从而影响与酶有效结合。这与Nojiri等(2014)研究酰胺酶拆分3-哌啶甲酰胺及其衍生物的结果一致。
目前, 生物酶法制备1-苯乙醇的研究主要通过水解和转酯化反应, 催化剂均来源于商业化的脂肪酶, 制备(S)-苯乙醇(表5)。本研究开发了一种来源于深海枯草芽孢杆菌酯酶BSE00077, 能够制备(R)-苯乙醇, 对映体过量值达到99%。
Tab. 5 Comparison of resolution of 1-phenylethanol by different esterase/lipases

表5 比较不同来源的酯酶和脂肪酶拆分1-苯乙醇

酶(来源) 反应方式 R/S-
苯乙醇		 对映体过量值/% 参考文献
脂肪酶Novozym 435(商业酶) 转酯化 S 87.5 (严祥辉 等, 2009)
C. antarctica
脂肪酶(商业酶)		 水解 S 99.5 (Fan et al, 2011)
C. lipolytica
脂肪酶(商业酶)		 转酯化 S 99.5 (范卫东 等, 2012)
酯酶BSE00077
(本研究)		 水解 R 99.0

4 结论

本研究从我国南海深海微生物中克隆并异源表达了酯酶BSE00077, 作为高效生物催化剂通过水解拆分反应制备了(R)-苯乙醇。通过对酯酶BSE00077拆分1-苯乙醇反应条件的优化, 发现该酯酶在pH 7.0和30℃条件下拆分2h时, 制备的(R)-苯乙醇对映体过量值达到99%, 转化率超过30%。同时比较了酯酶对不同侧链长度的1-苯乙醇酯的水解偏好性, 发现侧链长度对水解拆分有较大的影响。

The authors have declared that no competing interests exist.

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