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Journal of Tropical Oceanography >

2017 , Vol. 36 >Issue 5: 49 - 58

DOI: https://doi.org/10.11978/2017006

Orginal Article

Blood cell types and production of hybrid grouper E. fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus ♂

  • ZHOU Hui 1, 2 ,
  • CHEN Gang 1, 2 ,
  • DENG Chongxin 1
Expand
  • 1. Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524025, China
  • 2. Key Laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animal, Regular High Education Institute of Guangdong Province, Zhanjiang 524025, China
Corresponding author: CHEN Gang. E-mail:

Received date: 2017-01-09

  Request revised date: 2017-04-23

  Online published: 2017-09-22

Supported by

Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean (201205028)

Science and Technology Plan Projects of Guangdong Province (2016B020201009)

Special Project on the Integration of Industry, Education and Research of Guangdong Province (2013B090700010)

The Innovation Team Building Project of Guangdong Province Ordinary University (2015KCXTD021)

Special Project on Key Laboratory of Guangdong Higher Education (2013CXZDA019)

Regional Demonstration of Marine Economic Innovation and Development in Guangdong Province (GD2012-A02-003)

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热带海洋学报编辑部
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Abstract

To study the blood cell morphological classification and production characteristics of hybrid grouper Epinephelus fuscoguttatus♀ × Epinephelus lanceolatus♂, peripheral blood smears and tissues stamps (pronephros, kidney, spleen and liver) were made; cell staining and microscopic observation, differential leucocyte counts (DLC) of peripheral blood and observation of various types of blood cell development in the four types of tissues were conducted, and the results were compared with its female parent. The results showed that lymphocytes [(55.46±12.38)%], thrombcytes [(21.11±5.38)%], neutrophils [(19.44±12.02)%], monocytes [(1.66±2.13)%] and eosinophils [(2.33±1.91)%] were observed in peripheral blood. The pronephros showed the highest immature cells percentage [(16.12±0.30)%], followed by kidney [(7.90±0.35)%], spleen [(2.56±0.21)%] and liver [(0.97±0.18)%]. The results indicated that the major hematopoietic tissue of hybrid grouper was pronephros, followed by kidney. Besides, plasma cells were observed in the four types of tissues, basophils and macrophages were observed in stamps of pronephros, kidney and spleen, and huge primitive monocytes were observed in kidney stamps. Compared with the female parent, the ratio of lymphocytes in peripheral blood leukocytes was similar (+2.16%), with less thrombotic cells (-14.58%), and more neutrophils (+9.10%), eosinophils (+2.18%) and monocytes (+1.38%). The main hematopoietic tissues of hybrid grouper and its female parent were both pronephros, but the major tissues for lymphocytes production were different (kidney and pronephros, respectively); and the secondary hematopoietic tissues were different ((kidney and spleen). The proportion of immature cells in the tissues of the hybrid grouper was significantly higher than that of its female parent, showing active hematopoietic activity. The results of this study provide basic data of morphology classification and blood cell production for studying blood physiology, pathology of grouper and hybrid breeding of grouper.

Key words： hybrid grouper E. fuscoguttatus♀×; E. lanceolatus♂; blood cell; blood cell types; tissue; blood cell production

Cite this article

ZHOU Hui , CHEN Gang , DENG Chongxin . Blood cell types and production of hybrid grouper E. fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus ♂[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2017 , 36(5) : 49 -58 . DOI: 10.11978/2017006

鱼类血液中的红细胞具有运输、体液调节等功能, 白细胞则参与机体免疫及损伤修复, 在鱼类免疫抗病和维持生理状态稳定的过程中发挥了重要作用(邱郁春, 1992)。因此, 对鱼类的血细胞进行检测和研究, 能反映外界环境因子对鱼类健康状况的影响(尾琦久雄, 1982), 对于鱼类病理学和鱼类免疫学研究有重要意义。此外, 通过鱼类血细胞发生研究还可以追溯脊椎动物血细胞的演化规律(Morrow et al, 1980; 赵凤岐 等, 2007), 有助于开展生物遗传进化及遗传选育研究(舒琥 等2015)。虽然国内外关于鱼类血细胞形态、分类、功能及血细胞发生方面的研究报道已有不少(Ellis, 1977; Rowley et al, 1988; 赵凤岐 等, 2007), 但还有很多问题尚未有定论; 比如鱼类血液中有无浆细胞(Morrow et al, 1980), 鱼类血细胞分类组成在受到环境胁迫时的变化规律(王赛 等, 2011), 以及各种鱼类血细胞种类的差异是否与其生活环境、生活习性及遗传(舒琥 等, 2015)相关等, 这些问题的解答需要对各种鱼类血细胞的结构与功能进行深入研究, 并大量积累相关的研究资料。
石斑鱼是重要的海水经济鱼类, 研究者已对斜带石斑鱼Epinephelus coioides (张海发 等, 2004; 周晖 等, 2006)、褐点石斑鱼Epinephelus fuscoguttatus (王赛 等, 2011; 涂贵雄 等, 2012)、点带石斑鱼Epinephelus malabaricus (毛海涛 等, 2015)和杂交子一代青龙斑Epinephelus coioides ♀×Epinephelus lanceolatus♂(舒琥 等, 2015)的血细胞形态结构、血细胞发生以及血液生化指标进行了一些研究。本实验室近年来一直在从事鱼类血细胞相关研究, 特别是深入研究了3 种蛋白源替代鱼粉对褐点石斑鱼幼鱼血细胞发生以及血液指标的影响(王赛 等, 2011; 涂贵雄 等, 2012)。本研究所使用的杂交石斑鱼是褐点石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交子一代E. fuscoguttatus♀ × E. lanceolatus♂, 俗称珍珠龙趸, 具有生长快、抗病力强、肉质细嫩等优良性状, 现已成为我国主要的石斑鱼养殖品种。目前王燕等(2014)已报道了杂交石斑鱼与其亲本的形态特征差异, 舒琥等(2015)也通过对杂交子一代青龙斑二倍体和三倍体血液生理生化等指标以及红细胞和白细胞形态进行研究, 发现了二倍体与三倍体青龙斑的血液指标差异, 可为青龙斑二倍体和三倍体的鉴别及遗传育种提供理论依据。本文对杂交石斑鱼血细胞形态分类及血细胞发生进行研究, 并将其特点与本实验室前期已研究过的褐点石斑鱼(王赛 等, 2011)进行了比较, 不仅能为杂交石斑鱼血液生理学和病理学研究提供基础资料, 也能为石斑鱼杂交选育提供血细胞形态分类及血细胞发生方面的参考数据。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

杂交石斑鱼取自广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地, 运回实验室后在水槽中暂养7天, 选取健康无损伤的石斑鱼8尾(263.18±12.31g)开展实验。

1.2 实验方法

1.2.1 抽血
用2mL一次性无菌注射器从尾鳍后方尾静脉抽血。抽血前注射器中抽取少量10%甲醛润洗。
1.2.2 血细胞涂片、印片、染色与观察
杂交石斑鱼抽血、涂片、印片、染色按文献方法操作(邱郁春, 1992)。每尾鱼外周血液制作10张涂片, 选取其中染色效果最佳的5张涂片, 对每张涂片上约200个白细胞进行分类统计, 各类血细胞都随机选取20个, 测量细胞核与细胞大小。每尾鱼的头肾、体肾、脾脏及肝脏各制作5张组织印迹片。在每尾鱼的每块组织印迹片上随机取50个染色效果良好和细胞分布均匀的视野, 对视野内各类血细胞的原始型、幼稚型和成熟型进行分类统计; 每块组织印迹片上不同阶段的各类血细胞都随机取10~20个, 测量细胞核与细胞大小。显微摄影在YM310数字摄像机下进行, 血细胞类型及各类血细胞发育阶段划分参考陈方平的标准(陈方平, 2003)。

2 结果和分析

2.1 外周血液白细胞观察和测定结果

外周血液白细胞分类计数结果见表1。白细胞中数量最多的是淋巴细胞(55.46%)、血栓细胞(21.11%)和嗜中性粒细胞(19.44%), 而嗜酸性粒细胞(2.33%)和单核细胞(1.66%)比较少; 各类细胞大小的测定结果见表2。
Tab.1 Differential leucocyte counts (DLC) in peripheral blood of hybrid grouper

表1 杂交石斑鱼外周血液中主要白细胞分类计数(DLC)

细胞类型 个数 百分比/%
淋巴细胞 119.00±30.18 55.46±12.38
血栓细胞 45.29±9.01 21.11±5.38
嗜中性粒细胞 41.71±22.13 19.44±12.02
嗜酸性粒细胞 5.51±5.00 2.33±1.91
单核细胞 3.57±3.99 1.66±2.13

注: 表中数据为8尾实验鱼数据的平均值±标准差。

Tab.2 Leucocyte size in peripheral blood of hybrid grouper

表2 杂交石斑鱼外周血液中各类细胞大小

细胞类型 细胞大小 核大小
长径/µm 短径/µm 长径/µm 短径/µm
红细胞 12.35±1.45 6.21±0.51 4.53±0.32 3.41±0.18
大淋巴细胞 7.18±1.49 5.36±0.93 5.08±1.00 3.77±0.53
小淋巴细胞 5.74±0.62 4.53±0.39 4.86±0.64 3.73±0.49
血栓细胞 10.47±1.03 3.69±0.95 7.58±0.99 2.97±0.82
嗜中性粒细胞 9.82±1.43 7.50±0.92 6.10±0.87 4.61±0.61
嗜酸性粒细胞 7.42±1.05 6.32±0.98 4.85±0.50 4.24±0.61
单核细胞 13.21±1.12 11.87±1.32 8.98±0.68 7.44±1.12

注: 表中数据为8尾实验鱼数据的平均值±标准差。

2.2 杂交石斑鱼血细胞各发育阶段的形态学特点

杂交石斑鱼血细胞不同阶段各类血细胞的形态特征如下所述。
2.2.1 红细胞系
原红细胞 (primitive erythrocyte, PE, 图1a) 胞体较大, 圆形、椭圆形或梨型; 胞质量少, 呈不透明油画样蓝色或灰蓝色, 着色较均匀; 胞核近圆形或椭圆形, 通常约占细胞的2/3, 居中或稍偏, 边缘清晰, 呈浅紫红色或无色; 染色质不均匀, 常聚集成粗粒状或小块状, 呈深紫红色; 核仁不清晰。
早幼红细胞 (early immature erythrocyte, EIE, 图1n) 胞体圆形或椭圆形, 小于原红细胞; 胞质增加, 呈浅蓝色; 胞核圆形或椭圆形, 约占细胞的1/2, 居中或侧偏, 核边缘清晰, 呈浅紫红色或紫红色; 染色质颗粒凝聚常聚集成粗粒状, 呈紫红色; 核仁消失。
中幼红细胞 (middle immature erythrocyte, MIE, 图1j) 胞体圆形或椭圆形; 胞质比例进一步增加, 呈淡灰色, 不均匀; 胞核椭圆形, 通常约占细胞的1/3, 呈浅紫红色或无色, 核周有淡染区; 染色质向中央凝集成粗网状, 呈紫红色。
晚幼红细胞 (late immature erythrocyte, LIE, 图1j) 胞体呈长椭圆形, 较早红和中幼红细胞体积小; 胞质中血红蛋白逐渐出现, 呈灰褐色; 胞核椭圆形, 多居中或稍偏, 通常约占细胞的1/3, 呈浅紫红色; 染色质向中央凝集成团块状, 呈深紫红色。
Fig. 1 Blood cells of hybrid grouper. The blood cells in the plate were enlarged 1000 times; the scaleplate in the plate indicated 10 μm. (a-e) blood smear; (f-g) liver stamp; (h) kidney stamp; (i) spleen stamp; (j-n) pronephros stamp

图1 杂交石斑鱼血细胞
血细胞的放大倍数为1000倍, 图中标尺表示10μm. a—e. 外周血液涂片; f—g. 肝脏印迹片: h. 体肾印迹片; i. 脾脏印迹片; j—n. 头肾印迹片

成熟红细胞 (erythrocyte, Er, 图1a—h) 胞体通常为长椭圆形, 细胞表面光滑无突起, 大小与晚幼红细胞相似; 胞质丰富, 呈桔褐色; 胞核较小, 椭圆形或卵圆形, 多位于细胞中央, 通常约占细胞的1/3, 呈紫红色; 染色质进一步凝结成念珠环状, 呈紫黑色。
红细胞在发育过程中细胞由圆形变成长椭圆形, 胞体先缩小后变大, 胞核则逐渐缩小, 核质比变小; 胞质由蓝色到桔褐色, 反映了胞质内嗜碱性物质的减少以及血红蛋白逐渐出现和增多; 核内染色质不断凝集, 着色由紫红色到紫黑色。
2.2.2 粒细胞系
原粒细胞 (primitive myelocytic, PMy, 图1l) 胞体圆形或椭圆形, 胞质比例大于原红细胞, 呈灰蓝色, 不均匀, 胞质内无颗粒; 胞核圆形或椭圆形, 大多偏位甚至与细胞膜内切, 约占细胞的1/2, 呈浅紫红色或无色; 染色质呈粗沙粒状, 紫红色; 核仁较清晰。
早幼粒细胞 (promyelocytic, Pr, 图1n) 胞体圆形或椭圆形, 略小于原粒细胞, 胞呈灰蓝色或淡蓝色, 胞质中开始出现紫黑和紫红颗粒; 胞核圆形或椭圆形, 约占细胞的1/2, 常偏于一侧甚至与细胞膜内切, 呈浅紫红色; 染色质呈颗粒状, 排列较紧密, 紫红色; 核仁模糊或消失。
嗜中性中幼粒细胞 (middle immature neutrophil, MIN, 图1n) 细胞圆形或椭圆形, 大小及核质比类似原粒细胞, 呈淡灰蓝色, 含有较多紫红色颗粒; 胞核椭圆形或卵圆形, 约占细胞的1/2, 居中或稍偏, 呈浅紫红色; 染色质凝聚, 呈粗网状, 紫红色, 核仁消失。
嗜中性晚幼粒细胞 (late immature neutrophil, LIN, 图1n) 细胞大小与原粒细胞相似, 圆形或卵圆形, 胞质比例增加, 呈淡蓝色, 充满了较大大小不一的紫红色颗粒, 分布不均匀; 胞核多数为椭圆形, 少数出现凹陷, 约占细胞的1/3, 居中或稍偏, 呈浅紫红色; 染色质凝聚成粗网状, 深紫红色。
嗜中性粒细胞 (neutrophil, Ne, 图1b、n) 细胞大小与原粒细胞相似, 圆形或卵圆形, 胞质比例进一步增加, 无色, 充满细小的紫红色和橘红色颗粒; 胞核约占细胞的1/3, 多为椭圆形或卵圆形, 少数出现凹陷, 居中或稍偏, 呈浅紫红色; 染色质呈粗网状, 进一步向中央凝聚, 深紫红色或紫黑色。
嗜酸性粒细胞 (eosinophil, Eo, 图1d、m) 胞体圆形或椭圆形, 胞质淡紫红色, 其中充满大小不等的紫红色或橘红色颗粒, 以大颗粒为主, 分布不均匀; 胞核椭圆形或半圆形, 多偏一侧, 与质膜相切, 约占细胞的1/4~1/3; 染色质凝聚成团块或絮状, 紫红色。
嗜碱性粒细胞 (basophil, Ba, 图1k) 胞体圆形或椭圆形, 个体通常较大; 胞质淡紫红色, 含有众多黑褐色颗粒, 颗粒大小不一、分布不均匀, 部分将胞核覆盖; 胞核形态不规则, 边缘不清晰, 常偏于一侧, 呈浅紫红色; 染色质凝聚成絮状, 紫红色。
粒细胞发育过程中胞体大小变化复杂, 无明显趋势; 胞核则有逐渐缩小的趋势, 核质比也逐渐减小; 胞核形状由圆形到椭圆形并逐渐出现凹陷, 位置由与细胞膜内切到居中; 胞质比例逐渐增大, 颜色由灰蓝色到无色; 核染色质由颗粒状逐渐凝聚成粗网状, 核仁从有到无。原粒细胞的细胞质中不含颗粒, 早幼粒细胞胞质开始出现大小不一的紫红色颗粒, 此后颗粒逐渐增多和变小, 成熟嗜中性粒细胞胞质中已充满了大量细小的紫红色颗粒。
2.2.3 淋巴细胞系
原淋巴细胞 (primitive lymphocyte, PL, 图1k) 原淋巴细胞圆形或卵圆形, 是各类原始细胞中胞体最小的, 核质比在原始细胞中最大, 大于2/3; 胞质较少, 呈油画状蓝色, 不均匀; 胞核多偏位, 呈浅紫红色, 常有狭窄的核周淡染区; 染色质凝聚成絮状或块状, 呈深紫红色; 核仁通常较明显。
幼淋巴细胞 (immature lymphocyte, IL, 图1l)胞体近圆形或近椭圆形, 核质比减小, 约为2/3; 胞质增多, 呈浅蓝色; 胞核近圆形或近椭圆形, 偶有凹陷, 多居中或稍偏, 呈浅紫红色; 染色质凝集成粗网状, 呈深紫色, 核仁模糊不清或消失。
大淋巴细胞 (large lymphocyte, LL, 图1c) 胞体较大, 形态不规则, 多有伪足; 胞质量较多, 呈浅紫红色或浅紫蓝色; 胞核多为近椭圆形, 呈深紫红色; 染色质凝集成块状, 呈紫黑色。
小淋巴细胞 (small lymphocyte, SL图1c, 图1g—n) 胞体形态不规则, 多有伪足; 胞质多集中在伪足部分, 量很少, 呈淡蓝色或淡紫色; 胞核偏位, 多与细胞膜相切, 呈深紫红色; 染色质凝集成团, 呈深紫红色或紫黑色。
在发育过程中, 淋巴细胞的胞体和胞核都逐渐变小, 核质比先加大后减小; 胞质先增加后减少, 颜色由蓝色到浅蓝色或浅紫红色; 核染色质由块状凝聚成团状, 核仁逐渐消失。淋巴细胞在成熟后会分化成大淋巴细胞和小淋巴细胞两种类型, 其中小淋巴细胞占绝大多数。
2.2.4 单核细胞系
原单核细胞 (primitive monocyte, PMo, 图1j 胞体近圆形、椭圆形或梨形, 核质比约为1/2~2/3; 胞质不均匀, 呈蓝紫色或浅蓝紫色, 边缘不规则; 胞核偏位, 多与细胞膜相切, 近圆形或椭圆形, 偶有凹陷, 呈淡紫红色或无色; 紫红色染色质纤细疏松, 凝集成细网状, 分布不均匀; 核仁清晰明显。体肾中偶见直径约为原单核细胞1.5倍的巨大原单核细胞(huge primitive monocyte, HPMo, 图1h)。
幼单核细胞 (immature monocyte, Imo, 图1l、m) 胞体不规则, 核质比约为1/2; 胞质增多, 多呈灰蓝色, 常有少量空泡, 偶有伪足状突起; 胞核呈椭圆形或不规则形, 常偏位, 偶有凹陷, 呈紫红色; 染色质凝集成粗网状, 呈紫红色或深紫红色; 核仁模糊或消失。
单核细胞 (monocyte, Mo, 图1e、g、i、m) 胞体呈圆形、椭圆形或不规则形, 核质比约为1/3; 胞质丰富, 呈淡灰蓝色, 粗糙如一层细沙, 较均匀, 偶有空泡; 胞核多圆形或卵圆形, 多与细胞膜相切, 呈淡紫红色或无色; 染色质凝集成致密细网状、絮状或团块状, 呈紫红色或深紫红色; 无核仁。
巨噬细胞 (macrophage, Ma, 图1m) 在体肾和头肾中偶见, 胞体通常大于其他细胞, 呈不规则形状, 有伪足, 核质比约为1/3; 胞质非常丰富, 呈淡蓝色, 空泡众多; 胞核常偏位, 近椭圆形, 呈淡紫红色或无色; 染色质凝集成粗网状或絮状, 呈紫红色或深紫红色。
在发育过程中, 单核细胞胞体和胞核都逐渐变大, 核质比逐渐变小; 胞质逐渐增多, 染色由蓝紫色到淡灰蓝色, 染色质由细状变为粗网状、絮状或团块状, 核仁从有到无。
2.2.5 血栓细胞
血栓细胞(thrombcyte, Th, 图1a) 胞体体较小, 呈梭形(FT, 图1a)或椭圆形(OT, 图1a); 胞质较少或几乎没有, 不均匀, 呈浅紫红色或无色; 染色质凝集成絮状, 呈深紫红色; 无核仁。血栓细胞在外周血液中多呈梭形, 常聚集成群, 在组织中则多呈粒状。
2.2.6 浆细胞
浆细胞 (plasma cell, Pl, 图1f、i、l) 胞体多为近圆形或卵圆形, 核质比约为30%; 胞质丰富, 呈灰蓝色, 不均匀, 常有小空泡; 胞核多为近圆形或椭圆形, 偏位, 呈紫红色或无色; 染色质粗密, 凝集成块状, 常呈车辐状排列; 无核仁。

2.3 杂交石斑鱼4种组织印迹片的观察和测定结果

表3显示, 头肾印迹片中白细胞数量最多, 约占细胞总数的85%; 体肾印迹片中白细胞也较多, 约占细胞总数的65%; 脾脏和肝脏印迹片中则较少, 约占细胞总数的30%和10%。
Tab. 3 Percentage of different blood cell lines in four tissues of hybrid grouper

表3 杂交石斑鱼4种组织中各类血细胞的分类计数

细胞类型 头肾 脾脏 肝脏 体肾
个数 百分比/% 个数 百分比/% 个数 百分比/% 个数 百分比/%
原红细胞PE 26.43±10.74 0.81±0.39 0 0 0 0 5.43±1.99 0.21±0.10
幼红细胞IE 191.43±23.98 5.85±0.43 0 0 0 0 22.43±14.35 0.87±0.47
红细胞 Er 278.86±62.50 8.53±1.82 968.00±31.21 71.24±2.42 3402.71±163.71 90.28±1.85 1010.14±286.53 38.83±2.06
原粒细胞PMy 30.57±17.65 0.93±0.26 1.29±1.38 0.09±0.04 0 0 7.57±4.86 0.29±0.24
早幼粒细胞Pr 35.14±10.12 1.07±0.26 2.43±2.51 0.18±0.22 0 0 12.71±12.61 0.49±0.23
嗜中性中幼粒细胞
MIN		 19.43±13.15 0.59±0.32 0 0 0 0 7.57±4.65 0.29±0.24
嗜中性晚幼粒细胞
LIN		 60.00±18.10 1.83±0.21 0 0 0 0 9.00±6.76 0.35±0.23
嗜中性粒细胞Ne 118.00±17.08 3.61±0.41 17.57±6.48 1.29±0.24 2.29±5.62 0.06±0.19 26.86±11.22 1.04±0.31
嗜碱性粒细胞Ba 4.14±3.93 0.13±0.13 3.86±4.35 0.28±0.33 0 0 1.43±1.40 0.06±0.06
嗜酸性粒细胞Eo 15.00±4.00 0.46±0.15 58.86±13.53 4.33±0.53 8.14±0.90 0.22±0.24 13.57±8.32 0.53±0.30
原淋巴细胞PL 37.29±6.90 1.14±0.32 7.00±2.31 0.52±0.04 1.00±1.73 0.03±0.08 33.29±8.01 1.29±0.21
幼淋巴细胞IL 39.86±13.84 1.22±0.45 14.29±1.38 1.05±0.12 1.43±2.57 0.04±0.07 71.86±10.32 2.78±0.74
大淋巴细胞LL 25.86±9.26 0.79±0.14 5.00±1.53 0.37±0.14 1.60±4.58 0.04±0.29 8.29±2.43 0.32±0.21
小淋巴细胞SL 1707.86±701.32 52.21±2.20 184.00±21.40 13.54±1.32 248.57±35.88 6.60±0.41 1214.71±380.44 46.90±2.27
浆细胞Pl 92.19±4.08 2.82±0.13 10.29±1.13 0.76±0.10 6.43±1.29 0.17±0.28 86.29±9.88 3.34±0.37
原单核细胞PMo 30.43±6.55 0.93±0.25 4.86±3.71 0.36±0.28 2.57±3.15 0.07±0.07 7.71±6.21 0.30±0.20
幼单核细胞Imo 56.57±19.89 1.73±0.25 4.86±4.77 0.36±0.36 31.29±6.68 0.83±0.47 26.71±11.56 1.03±0.72
单核细胞Mo 15.14±4.56 0.46±0.2. 6.86±1.19 0.50±0.17 25.57±8.98 0.68±0.82 14.14±3.76 0.55±0.25
血栓细胞Th 486.71±30.21 14.88±0.97 69.57±13.70 5.12±0.97 37.29±8.74 0.99±0.23 15.43±3.91 0.60±0.34

注: 表中数据为8尾实验鱼数据的平均值±标准差。

如表4所示, 杂交石斑鱼头肾中未成熟红细胞、淋巴细胞、粒细胞、单核细胞以及未成熟细胞总数比例明显高于其他3种组织; 体肾又明显高于脾脏和肝脏; 脾脏中未成熟淋巴细胞的比例较高, 而肝脏中未成熟单核细胞比例较高。
Tab. 4 Percentage of immature blood cells in four tissues of hybrid grouper (%)

表4 杂交石斑鱼4种组织中各类未成熟细胞占总细胞数的百分比(%)

组织 红细胞 淋巴细胞 粒细胞 单核细胞 总数
头肾 6.66±0.40 2.36±0.34 4.44±0.24 2.66±0.23 16.12±0.30
体肾 1.08±0.29 4.07±0.44 1.42±0.23 1.33±0.46 7.90±0.35
脾脏 0 1.57±0.14 0.27±0.13 0.72±0.33 2.56±0.21
肝脏 0 0.07±0.07 0 0.90±0.31 0.97±0.18

注: 表中数据为8尾实验鱼数据的平均值±标准差。

各类细胞不同发育阶段大小的测量结果见表5。
Tab. 5 Size of different blood cell lines at different stages in four tissues of hybrid grouper

表5 杂交石斑鱼4种组织中各阶段不同类型血细胞大小

细胞系 细胞大小 细胞核大小
长径/µm 短径/µm 长径/µm 短径/µm
原红细胞 PE 9.31±0.74 7.65±1.28 6.99±1.06 5.61±0.93
早幼红细胞 EIE 7.79±1.26 6.60±0.71 5.21±0.49 4.72±0.64
中幼红细胞 MIE 8.15±0.65 6.60±0.94 5.15±0.55 4.46±0.48
晚幼红细胞 LIE 8.62±0.92 5.57±0.91 5.06±0.56 3.89±0.47
红细胞 Er 12.26±1.10 6.38±0.48 4.70±0.38 3.29±0.21
原粒细胞PMy 10.32±1.40 8.75±1.43 7.41±0.68 6.46±1.06
早幼粒细胞Pr 9.54±0.73 8.86±0.55 7.08±0.53 5.95±0.51
嗜中性中幼粒细胞MIN 10.34±1.23 9.01±1.28 6.81±0.74 5.61±0.74
嗜中性晚幼粒细胞LIN 9.15±0.81 8.40±0.72 6.13±0.32 5.36±0.54
嗜中性粒细胞Ne 10.39±0.70 9.78±0.69 5.84±0.48 5.16±0.37
嗜碱性粒细胞Ba 8.91±0.41 8.01±0.60 6.11±0.65 5.19±0.59
嗜酸性粒细胞Eo 7.72±0.66 6.77±0.69 5.53±0.47 4.77±0.38
原淋巴细胞PL 7.76±0.99 6.31±0.76 6.24±0.84 5.33±0.75
幼淋巴细胞IL 7.08±0.64 5.64±0.39 5.92±0.52 5.19±0.40
大淋巴细胞LL 6.86±1.37 5.97±0.93 5.20±1.16 4.74±0.80
小淋巴细胞SL 6.12±0.78 5.32±0.73 5.03±0.57 4.16±0.50
浆细胞Pl 10.04±1.47 8.68±0.94 6.09±0.69 4.91±0.74
原单核细胞PMo 9.37±1.16 8.44±1.65 7.62±0.78 6.08±1.08
幼单核细胞Imo 11.72±0.99 10.92±0.67 8.53±1.17 5.75±0.87
单核细胞Mo 13.20±1.57 10.37±1.25 8.15±1.34 6.46±0.96
血栓细胞Th 4.47±0.21 3.75±0.28 4.24±0.16 3.72±0.31
巨噬细胞 Ma 15.19±1.93 11.29±1.73 8.14±0.48 6.87±0.69

注: 表中数据为8尾实验鱼数据的平均值±标准差。

3 讨论

3.1 杂交石斑鱼外周血液中血细胞的分类组成特点

在杂交石斑鱼的外周血液中常见白细胞是淋巴细胞(55.46%)、血栓细胞(21.11%)和嗜中性粒细胞(19.44%), 嗜酸性粒细胞(2.33%)和单核细胞(1.66%)只能偶然观察到(表1)。众多研究表明, 各种鱼类外周血液的血细胞分类组成差异极大, 但一般都具有红细胞、淋巴细胞、血栓细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞, 比如点带石斑鱼(毛海涛 等, 2015)、军曹鱼Rachycentron canadum (陈刚 等, 2005)、卵形鲳鲹Trachinotus ovatus (张健东 等, 2007)等; 在褐点石斑鱼(王赛 等, 2011)、青龙斑(舒琥 等, 2015)、美国红鱼Csiaenops ocellatus (陈刚 等, 2006)和黑鲷Sparus macrocephalus (梅景良 等, 2008)等鱼类的外周血液中还观察到了嗜酸性粒细胞, 在斜带石斑鱼(张海发 等, 2004)和美国红鱼(陈刚 等, 2006)外周血中则同时观察到了嗜酸性和嗜碱性粒细胞, 而在小点猫鲨Scyliorhinus canicula (Morrow et al, 1980)、黑鲷(梅景良 等, 2008)和褐点石斑鱼(王赛 等, 2011)等鱼类的外周血液或组织中还观察到了浆细胞。
文献报道的不同鱼类外周血液中各类白细胞的比例差异极大。与杂交石斑鱼相似, 点带石斑鱼(毛海涛 等, 2015)、褐点石斑鱼(王赛 等, 2011)、卵形鲳鲹(张健东 等, 2007)和斜带石斑鱼(周晖 等, 2006)外周血中的白细胞也以淋巴细胞为主, 分别占白细胞总数的72.10%、53.30%、52.52%和46.57%, 而军曹鱼(陈刚 等, 2005)、美国红鱼(陈刚 等, 2006)和黑鲷(梅景良 等, 2008)的淋巴细胞分别只占外周血中白细胞总数的16.60%、14.50%和2.99%, 其外周血液中的白细胞以血栓细胞为主, 分别占白细胞总数的61.20%、68.42%和78.21%, 而卵形鲳鲹(张健东 等, 2007)、褐点石斑鱼(王赛 等, 2011)、斜带石斑鱼(周晖 等, 2006)和点带石斑鱼(毛海涛 等, 2015)外周血中血栓细胞只占白细胞总数的38.23%、35.69%、21.28%和3.05%。淋巴细胞(Jansson et al, 2003)和血栓细胞(Köllner et al, 2004)对于鱼类免疫都具有重要意义, 因此准确测定其在鱼类外周血液中所占的比例对于开展鱼类免疫研究是非常重要的。Ellis (1977)认为, 鱼类血栓细胞在不使用抗凝剂采血时会呈现泪滴形、梭形、卵圆形或孤核形这4种形态, 是鱼体对采血的应激反应。Rowley等(1988)则指出, 若使用合适的抗凝剂, 血栓细胞的形态为卵圆形和梭形。在杂交石斑鱼外周血液中同样可以观察到梭形和卵圆形两类血栓细胞, 合计占白细胞总数的21.11%, 相对较少。卵圆形血栓细胞容易与淋巴细胞混淆, 因此在观察计数中对此类细胞的划分必须非常谨慎。
粒细胞在鱼类外周血液中也很常见, 特别是嗜中性粒细胞数量较多。点带石斑鱼(毛海涛 等, 2015)、军曹鱼(陈刚 等, 2005)、斜带石斑鱼(周晖 等, 2006)、褐点石斑鱼(王赛 等, 2011)、卵形鲳鲹(张健东 等, 2007)和美国红鱼(陈刚 等, 2006)嗜中性粒细胞数量分别占白细胞总数的21.03%、16.00%、14.66%、10.34%、9.25%、2.61%。杂交石斑鱼外周血中嗜中性粒细胞占白细胞总数19.44%, 与点带石斑鱼相似, 高于上述其他鱼类。除嗜中性粒细胞之外, 在杂交石斑鱼的外周血液中还观察到了少量嗜酸性粒细胞, 仅占白细胞总数2.33%。
单核细胞在鱼类外周血液白细胞中所占比例通常小于10%, 比如点带石斑鱼(毛海涛 等, 2015)、军曹鱼(陈刚 等, 2005)、黑鲷(梅景良 等, 2008)和美国红鱼(陈刚 等, 2006)单核细胞比例分别是6.87%、6.20%、4.70%和1.46%, 在褐点石斑鱼(王赛 等, 2011)和卵形鲳鲹(张健东 等, 2007)外周血液中单核细胞的比例甚至低于1%; 但是也有例外, 比如在斜带石斑鱼(周晖 等, 2006)外周血液中, 白细胞中单核细胞的比例却高达到17.50%。杂交石斑鱼外周血液中单核细胞占白细胞总数的比例仅为1.66%, 相对较少。
杂交石斑鱼与其母本褐点石斑鱼相比, 淋巴细胞比例接近, 分别是55.46%比53.30%; 血栓细胞较少, 分别是21.11%比35.69%; 嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞都较多, 分别是19.44%比10.34%、2.33%比0.15%, 以及1.66%比0.28%。

3.2 杂交石斑鱼的主要造血组织

众多研究结果表明, 鱼类的造血组织并不相同。硬骨鱼类肾脏的前部(前肾或头肾)通常被认为类似于哺乳动物骨髓, 具有造血功能(Zapata, 1979), 体肾是造血干细胞归巢和分化的场所(Zapata et al, 1995), 脾的造血作用通常限于红细胞生成和血栓细胞生成(Rowley et al, 1988)。以各组织中未成熟细胞占细胞总数的比例为依据(表3和4), 杂交石斑鱼的主要造血组织是头肾; 红细胞及白细胞都主要在头肾发生, 这与褐点石斑鱼(王赛 等, 2011)相似; 而斜带石斑鱼(周晖 等, 2006)、点带石斑鱼(毛海涛 等, 2015)、军曹鱼(陈刚 等, 2005)以及美国红鱼(陈刚 等, 2006)的主要造血组织为头肾、体肾和脾脏。杂交石斑鱼的体肾也具有重要的造血功能, 可以产生各类原始细胞, 特别是在淋巴细胞的产生中具有重要意义; 脾脏和肝脏造血能力较弱, 其中脾脏在淋巴细胞和单核细胞产生方面具有较大作用, 而肝脏只对单核细胞产生具有一定作用。
在各类细胞的组织分布方面, 杂交石斑鱼未成熟的红细胞、单核细胞和粒细胞主要在头肾印迹片中出现, 未成熟的淋巴细胞主要在体肾、头肾和脾脏印迹片中出现(见表3和4); 而褐点石斑鱼未成熟的红细胞、淋巴细胞和粒细胞主要在头肾印迹片中出现, 未成熟的单核细胞主要在头肾和脾脏印迹片中出现; 杂交石斑鱼与褐点石斑鱼淋巴细胞的主要发生组织不同。杂交石斑鱼与其母本褐点石斑鱼的主要造血组织都是头肾, 但杂交石斑鱼头肾中未成熟细胞比例更高(16.12%), 褐点石斑鱼只有7.82%; 另外杂交石斑鱼第二重要的造血组织是体肾(7.90%), 而褐点石斑鱼则是脾脏(1.24%)。总体而言杂交石斑鱼各组织中未成熟细胞比例显著高于褐点石斑鱼, 显示出活跃的造血活动。

3.3 杂交石斑鱼的特殊类型血细胞

3.3.1 浆细胞
浆细胞是B-淋巴细胞在抗原刺激下分化增殖而形成的一种不再具有分化增殖能力的终末细胞, 具有高效合成、贮存抗体的功能, 参与体液免疫反应。外周血液中浆细胞的出现可以反映生物受到抗原刺激(Morrow et al, 1980)。杂交石斑鱼的4种组织均有浆细胞存在, 在头肾和体肾中比较多, 与褐点石斑鱼相似; 但在外周血液中却未发现有浆细胞存在。
3.3.2 巨大原单核细胞
在杂交石斑鱼的体肾中发现体积约为普通细胞1.5倍的巨大原单核细胞, 其细胞染色形态与原单核细胞相同, 核质比也接近。作为杂交石斑鱼亲本之一的褐点石斑鱼则具有类似的巨大原红细胞, 两者的差别主要在于巨大原红细胞的染色质为粗颗粒状, 巨大原单核细胞的染色质呈浓密的细丝网状。
3.3.3 巨噬细胞
Ellis(1977)认为, 鱼类巨噬细胞由单核细胞发育形成, 具有强大的吞噬功能。褐点石斑鱼(王赛 等, 2011)的巨噬细胞出现在肝脏中, 卵形鲳鲹(张健东 等, 2007)的巨噬细胞出现在肾脏中, 本实验在杂交石斑鱼的脾脏、头肾和体肾中均观察到体积巨大的巨噬细胞。

The authors have declared that no competing interests exist.

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