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2018 , Vol. 37 >Issue 1: 12 - 19

DOI: https://doi.org/10.11978/2017017

Orginal Article

Studies on intraspecies diversity of Pseudo-nitzschia pungens from Chinese coastal waters*

  • DONG Huanchang , 1, 2 ,
  • HUANG Chunxiu 1, 2 ,
  • XU Guoshuang 1, 2 ,
  • LI Yang , 1, 2
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  • 1. Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China
  • 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Healthy and Safe Aquaculture, College of Life Science, South China Normal University,Guangzhou 510631, China
Corresponding author: LI Yang. E-mail:

Received date: 2017-02-15

  Request revised date: 2017-05-26

  Online published: 2018-02-02

Supported by

National Natural Science Foundation of China (31570205, 31370235)

Science and Technology Planning Project of Guangzhou, China (201607010370)

Copyright

热带海洋学报编辑部
Fold

Abstract

To declare intraspecies diversity of Pseudo-nitzschia pungens Hasle, a total of 32 monoclonal strains of P. pungens from Chinese coastal waters were isolated and established. These strains were identified carefully, based on the morphology under both light microscopy and transmission electron microscopy, and on the molecular analysis inferred from the internal transcribed spacer region sequences. Two varieties were identified: P. pungens var. pungens (Grunow) Hasle and P. pungens var. averiensis Lundholm, Churro, Carreira, and Calado. Their morphologies were described and compared with allied taxa. Meanwhile, domoic acid (DA) was detected using a liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) injection, but no detectable DA was found. The results may provide detailed information for further studies of toxin production of Chinese Pseudo-nitzschia strains.

Key words： Pseudo-nitzschia pungens; taxonomy; morphology; internal transcribed spacer; domoic acid

Cite this article

DONG Huanchang , HUANG Chunxiu , XU Guoshuang , LI Yang . Studies on intraspecies diversity of Pseudo-nitzschia pungens from Chinese coastal waters*[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2018 , 37(1) : 12 -19 . DOI: 10.11978/2017017

拟菱形藻(Pseudo-nitzschia Peragallo)是全球近岸水域常见浮游硅藻(Lelong et al, 2012; Trainer et al, 2012)。人们对于拟菱形藻的高度关注始于1987年的一次中毒事件(Bates et al, 1989), 研究发现拟菱形藻能产生记忆缺失性贝毒(ASP)—多莫酸(DA)。
首次中毒事件之后, 拟菱形藻获得高度关注, 其物种多样性研究也快速增加, 并取得了显著成果。截至目前, 国际上报道的拟菱形藻物种已有48个(Teng et al, 2016; Lundholm, 2017)。拟菱形藻已成为最为熟悉的类群之一, 但其物种的准确识别仍具较大难度, 因为除了传统形态特征之外, 还涉及多种现代分子生物学技术的同步应用, 如基于核糖体转录间隔区(ITS)的分子系统学数据、ITS2-RNA二级结构对比、生殖隔离的分子水平分析等(Amato et al, 2007; Lim et al, 2012、2013; Teng et al, 2015、2016)。我国拟菱形藻物种多样性的工作相对零散, 目前报道了24种(LÜ et al, 2012; 徐国双 等, 2015; 黄春秀 等, 2016), 但是基于现代分类学方法的工作较少。
尖刺拟菱形藻Pseudo-nitzschia pungens Hasle是拟菱形藻属的典型物种, 也是全球广布种(Casteleyn et al, 2008、2009; Moschandreou et al, 2012)。该种在中国沿海普遍存在, 也是藻华原因种, 大连、青岛、长江口、厦门港及南海北部多个港湾都有其藻华报道(吕颂辉 等, 1992; Zou et al, 1993; Qi et al, 1994; Yang et al, 2002)。另外, 尖刺拟菱形藻也是重要的产毒种之一, 在新西兰(Rhodes et al, 1996)、美国的华盛顿(Trainer et al, 1998)、蒙特利尔湾和加利福尼亚(Bates et al, 1998)都有产毒并引起人类和高等动物中毒的报道。我国学者也曾对东海的尖刺拟菱形藻进行了毒素检测, 但并没有检测到多莫酸(李爱峰, 2005)。
目前国际上对于尖刺拟菱形藻的种下分类学已有较为清晰的认识, 报道了3个变种(Casteleyn et al, 2008; Kim et al, 2015), 而我国的认识仍停留在原种水平。本文研究了我国沿海尖刺拟菱形藻的种下分类学现状, 并明确其是否能够产生DA。

1 材料和方法

1.1 单克隆藻株的建立

利用浮游植物网(孔径10μm)进行水平拖网, 采集活体样品, 并尽快带回实验室。利用毛细管法在倒置显微镜下挑取目标藻细胞, 转移至盛有f/2培养液的载玻片上, 经过多次水洗和转移, 以确保目标藻的纯化, 然后再转移至滴有f/2培养液的96孔细胞培养板中(Guillard et al, 1993), 放置在室温20℃、光周期12h:12h的条件下培养。待其存活并繁殖达到一定细胞数量之后, 转移到盛有f/2培养液的100mL锥形瓶中培养, 以MC (marine collection)序列进行编号。本文藻株详细信息见表1。
Tab. 1 List of P. pungens monoclonal strains established in this study

表1 本文建立的尖刺拟菱形藻单克隆培养株系

株系 分离地点 采样时间 种名
MC215 珠海 2013年5月 P. pungens var. pungens
MC218 葫芦岛 2013年8月 P. pungens var. pungens
MC241 惠州 2013年10月 P. pungens var. averiensis
MC255 厦门 2013年11月 P. pungens var. averiensis
MC263 青岛 2013年11月 P. pungens var. averiensis
MC289 青岛 2014年2月 P. pungens var. pungens
MC290 青岛 2014年2月 P. pungens var. pungens
MC295 惠州 2014年4月 P. pungens var. pungens
MC404 惠州 2014年7月 P. pungens var. averiensis
MC830 温州 2015年5月 P. pungens var. pungens
MC831 温州 2015年5月 P. pungens var. pungens
MC841 香港 2015年7月 P. pungens var. averiensis
MC864 宁波 2015年8月 P. pungens var. averiensis
MC867 宁波 2015年8月 P. pungens var. averiensis
MC881 湛江 2015年8月 P. pungens var. averiensis
MC888 湛江 2015年8月 P. pungens var. averiensis
MC899 青岛 2015年9月 P. pungens var. averiensis
MC915 深圳 2015年9月 P. pungens var. averiensis
MC988 台湾海峡 2016年5月 P. pungens var. pungens
MC3052 珠海 2016年5月 P. pungens var. pungens
MC3053 珠海 2016年5月 P. pungens var. averiensis
MC3054 珠海 2016年5月 P. pungens var. pungens
MC3057 珠海 2016年5月 P. pungens var. pungens
MC3058 珠海 2016年5月 P. pungens var. pungens
MC3059 珠海 2016年5月 P. pungens var. pungens
MC3060 珠海 2016年5月 P. pungens var. averiensis
MC3061 珠海 2016年5月 P. pungens var. pungens
MC3062 珠海 2016年5月 P. pungens var. pungens
MC3065 珠海 2016年5月 P. pungens var. pungens
MC3067 珠海 2016年5月 P. pungens var. pungens
MC3119 黄海
N:122°50′, E:32°00′		 2016年7月 P. pungens var. pungens
MC3195 台湾海峡 2016年8月 P. pungens var. averiensis

1.2 形态学观察

光镜(LM)观察: 取对数生长期藻液0.1mL, 滴在0.1mL浮游植物计数框中, 加上盖玻片后在Olympus BX53光学显微镜下进行微分干涉(DIC)观察, 并利用Olympus DP27数码相机拍照。
透射电镜(TEM)观察: 取对数生长期藻液10mL, 静置沉淀浓缩至2~5mL, 加入等量浓硫酸(>95%)以去除有机质, 然后用蒸馏水多次水洗至中性(程兆第 等, 1993)。用微量进样器吸取5~10μL酸化后的水样, 滴加在喷镀碳膜的铜网上, 自然晾干后, 即可在JEM-1010 TEM下观察和拍照。

1.3 分子系统学分析

用0.22μm醋酸纤维滤膜过滤对数生长期藻液10mL, 收集滤膜上的藻细胞, 进行总DNA的提取(Lundholm et al, 2002)。利用引物ITS1 (TCCGTA GGTGAACCTGCGG)和ITS4 (TCCTCCGCTTATTG ATATGC)进行核糖体转录间隔区(ITS)的扩增和测序(Lim et al, 2012)。从美国国家生物技术信息中心(NCBI)下载拟菱形藻的ITS序列, 使用BioEdit软件进行序列的比对和矩阵(Hall, 1999), 基于MrModeltest 2.3计算的最适模型(Nylander, 2004), 然后分别用RAxML-HPC2 (Miller et al, 2010)和MrBayes 3.2 (Ronquist et al, 2012)构建最大似然树(ML)和贝叶斯推理树(BI)。其中ML分析的自检值(bootstrap test)设定为1000。

1.4 LC-MS/MS法检测多莫酸

取处于生长稳定期中后期的藻液5mL, 经0.22μm醋酸纤维滤膜过滤, 收集滤液于离心管中, 用于分析胞外多莫酸量; 另外用5mL灭菌海水将滤膜上的藻细胞重悬, 转移到另一个离心管中。将藻液用超声波破碎仪冰浴破碎3~5min, 经0.22μm滤膜过滤, 滤液于-20℃下保存备用或直接进样分析。
采用Prominence UFLC超快速液相色谱(Shimadzu公司)和5500 QTRAP四极杆-线性离子阱复合质谱检测系统(SCIEX公司)对预处理的样品进行多莫酸检测, 参见Wu等(2014)方法进行分析。本方法的检测下限为10ng•mL-1。多莫酸标准品购自德国Sigma公司。

2 结果

2.1 尖刺拟菱形藻的种下分类学研究

基于形态学特征和分子系统学数据, 对采自中国沿海的尖刺拟菱形藻进行了种下分类学研究, 本文鉴定得到尖刺拟菱形藻的两个变种, 分别是尖刺拟菱形藻原变种Pseudo-nitzschia pungens var. pungens (Grunow) Hasle和尖刺拟菱形藻阿维罗变种Pseudo-nitzschia pungens var. averiensis Lundholm, Churro, Carreira & Calado。

2.2 形态学描述

2.2.1 尖刺拟菱形藻原变种Pseudo-nitzschia pungens var. pungens (Grunow) Hasle (图1)
Fig. 1 Pseudo-nitzschia pungens var. pungens. (a) LM, chain colony; (b) shape of whole valve; (c) valve end; (d) valve end; (e) middle of valve; (f) detail of poroids; (g) bands. b’g: TEM

图1 尖刺拟菱形藻原变种
a. 细胞的链状群体(LM观察); b. 壳面外形; c. 壳端; d. 壳端; e. 壳面中部; f. 孔纹结构; g. 环带。b~g为TEM观察

细胞具有两个黄褐色的色素体, 对称分布在横轴两侧。细胞可形成链状群体(图1a), 重叠部为壳面全长的1/3~1/4。细胞壳面呈线形至披针形(图1b), 壳端尖细(图1c、1d), 两壳端形状相似。壳面强硅质化, 在光镜下可见肋纹和肋突。壳面长71~88µm, 宽2.8~3.2µm。管壳缝强烈偏心(图1e)。无中央较大船骨点(图1e)。肋突分布在壳缘, 排列规则(图1e), 肋突密度为10~12×10-1个•µm-1。点条纹一般由两排孔纹组成, 密度为11~14×10-1条•µm-1, 有时在两排孔纹间会出现单个孔纹(图1e、1f)。孔纹呈现长椭圆形, 密度3~4个•µm-1。观察到2条环带(图1g), 第一条环带点条纹密度15~18×10-1个•µm-1, 环带宽3~4个孔纹, 高1个孔纹, 孔纹呈现长椭圆形(图1g); 第二条环带一侧有孔纹, 另一侧为无纹区。
该变种属于全球广布种(Casteleyn et al, 2008; Kim et al, 2015), 本文标本均采自于中国海域, 如葫芦岛、青岛、珠海、温州等地。
2.2.2 尖刺拟菱形藻阿维罗变种Pseudo-nitzschia pungens var. averiensis Lundholm, Churro, Carreira & Calado (图2)
Fig. 2 Pseudo-nitzschia pungens var. averiensis. (a) LM, chain colony; (b) shape of whole valve; (c) valve end; (d) middle of valve; e~h: bands; b~h: TEM

图2 尖刺拟菱形藻阿维罗变种
a. 细胞的链状群体(LM观察); b. 壳面外形; c. 壳端; d. 壳面中部; e~h为环带; b~h为TEM观察

细胞具有两个黄褐色的色素体, 对称分布在横轴两侧。细胞可形成链状群体(图2a), 重叠部为壳面全长的1/3~1/4。细胞壳面呈线形至披针形(图2b), 壳端尖细(图2c), 两壳端形状相似。壳面强硅质化, 在光镜下可见肋纹和肋突。壳面长55~73µm, 宽3.0~4.0µm。管壳缝强烈偏心(图2c、2d)。无中央较大船骨点(图2d)。肋突分布在壳缘, 排列规则(图2d), 肋突密度为13~16×10-1个•µm-1。点条纹一般由两排孔纹组成(图2d), 密度为12~16×10-1条•µm-1, 偶尔在两排孔纹间会出现单个孔纹(图2d)。孔纹呈现圆形, 密度3~4个•µm-1。观察到3条环带(图2h), 第一条环带上孔纹两侧都存在无纹区, 点条纹密度19~25×10-1个•µm-1, 环带宽2~3个孔纹, 高1个孔纹, 孔纹多呈现方形(图2e~2h), 可观察到孔纹被分隔成2~3部分的情况; 第二条环带一侧有孔纹, 另一侧为无纹区, 孔纹呈现长椭圆或方形(图2g、2h); 第三条环带也是一侧有孔纹, 另一侧为无纹区(图2h)。
该变种属于全球广布种(Casteleyn et al, 2008; Kim et al, 2015), 在中国沿海也广泛分布, 本种采自于中国海域的青岛、宁波、厦门、香港、湛江等地。

2.3 基于ITS序列分析的分子系统学分析

利用RAxML对32株尖刺拟菱形藻的ITS1-5.8S- TS2序列进行了比对分析, 建立了分子系统树(图3)。所有尖刺拟菱形藻均呈现较好的单系起源(BI=0.99/ML=98), 并可清晰地划分为3个类群, 本文株系分别归入其中两个类群。其中18个实验株系和西班牙株系(Ner-M7、Ner-J9)聚在一个小的分支上, 具有较高的置信值(BI=0.93/ML=97), 属于尖刺拟菱形藻原变种类群。本文的18个尖刺拟菱形藻原变种株系具有完全一致的ITS碱基序列, 但是与西班牙株系(Ner-M7)有1~2个碱基差异, 与另一个西班牙株系(Ner-J9)有5个碱基差异。本文的另外14个实验株系与西班牙株系(Theta4、Ner-P2)、韩国株系(HYNG1010PP29F5、HYNH1010PP29B9)聚在另一个小的分支上, 属于尖刺拟菱形藻阿维罗变种类群。本文的14个尖刺拟菱形藻阿维罗变种株系与韩国的两个株系(HYNG1010PP29F5、HYNH1010PP29B9)只有1个碱基的差异, 同属于Ⅲaa小类群, 而与西班牙株系(Theta4、Ner-P2)有8个碱基的差异。分子系统学数据支持形态学鉴定的结果。
Fig. 3 Molecular phylogenetic tree based on ITS1-5.8S-ITS2 rDNA with Pseudo-nitzschia delicatissima as outgroups

图3 基于核糖体转录间隔区ITS1-5.8S-ITS2的分子系统树
以Pseudo-nitzschia delicatissima为外类群, 分支上的数字表示1000次自展检验的置信度BPP/ML

2.4 多莫酸产毒特征的LC-MS检测

以多莫酸标准品质量浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 建立多莫酸LC-MS检测的标准曲线, 多莫酸浓度为0.1~16μg•mL-1时, 其峰面积与质量浓度有良好的线性关系(r2=0.9999), 回归方程为: y=87.1875x。多莫酸的出峰保留时间为13.613min。对常规培养的32株尖刺拟菱形藻进行LC-MS检测, 结果在预定的保留时间内都未出现样品峰。表明这些藻株均未检出多莫酸。

3 讨论

3.1 尖刺拟菱形藻变种之间的比较研究

尖刺拟菱形藻是拟菱形藻属的典型物种, 也是全球近岸广布种, 曾在世界多个海域引发藻华(Hasle et al, 1997; Hasle, 2002)。以往研究大多只是鉴定到种的水平, 但在高分辨率电镜技术和分子生物学技术引入之后, 人们发现其种下还具有一定的多样性。Villac等(1998)基于形态学区别, 报道了尖刺拟菱形藻环带变种Pseudo-nitzschia pungens var. cingulata, Casteleyn等(2008)结合形态学与分子系统学数据再次验证上述观点。随后Churro等(2009)结合形态学与分子系统学数据, 发现另一个变种—尖刺拟菱形藻阿维罗变种。3个变种之间具有较多相似的形态学特征: 细胞个体大, 壳面线形至披针形, 两端尖细, 无中央较大船骨点, 点条纹一般由两排孔纹组成, 孔纹呈规则圆形。它们之间的主要形态学区别在于环带结构。尖刺拟菱形藻原变种有3条环带, 所有环带都具有1排横向的椭圆形孔纹(Hasle, 1995, Fig. 10; Hasle et al, 1996; Skov et al, 1999)。尖刺拟菱形藻环带变种环带有两种类型, 一种是有1排孔纹, 另一种是有两排2~3个孔纹(Casteleyn et al, 2008, Fig. 4)。尖刺拟菱形藻阿维罗变种的壳环带和第二条环带的孔纹具有裂缝(Churro et al, 2009, Fig. 51)。本文建立的尖刺拟菱形藻原变种株系可观察到2条环带, 环带上孔纹呈现椭圆形, 环带上点条纹密度(15~18×10-1个•µm-1)低于尖刺拟菱形藻环带变种(20~24×10-1个•µm-1) (Villac et al, 1998)。尖刺拟菱形藻阿维罗变种壳环带孔纹具有裂痕, 其环带上点条纹密度(19~25×10-1个•µm-1)与尖刺拟菱形藻环带变种相似, 但高于尖刺拟菱形藻原变种。结合形态学与分子系统学数据, 本文报道了我国尖刺拟菱形藻的两个变种, 而尖刺拟菱形藻环带变种是否在我国海域也有分布, 尚不可知。
除了形态特征上的细微区别, 尖刺拟菱形藻的3个变种也存在一定的遗传差异。Casteleyn等(2008)依据分子系统学数据, 发现尖刺拟菱形藻的不同地理株系在系统树上划分为3个类群, 从而验证了尖刺拟菱形藻3个变种的存在。随后Churro等(2009)在系统学研究中发现类群Ⅲ又划分为两个小类群, 分别为Ⅲa和Ⅲb, 但是并没有发现这两个小类群的形态学区别。2015年Kim等基于ITS系统树发现cladeⅢ可划分为3个小类群, 分别为Ⅲaa、Ⅲab和Ⅲb (Kim et al, 2015)。本文系统发育树也出现3个类群, 分别对应尖刺拟菱形藻的3个变种。另外cladeⅢ出现两个小类群, 本文的尖刺拟菱形藻阿维罗变种与韩国两个株系(HYNG1010PP29F5、HYNH1010 PP29B9)(Kim et al, 2015)聚在同一个分支上, 同属于Ⅲaa。

3.2 尖刺拟菱形藻的多莫酸特征分析

目前报道的48个拟菱形藻物种之中, 24种有产生多莫酸的报道(Teng et al, 2016; Lundholm, 2017), 其中就包括尖刺拟菱形藻。Villac等(1998)对尖刺拟菱形藻环带变种进行了毒素检测, Churro等(2009)对尖刺拟菱形藻阿维罗变种也进行了毒素检测, 均未检测到多莫酸。尖刺拟菱形藻的产毒能力是一个比较复杂的情况, 有着地域和种源的差异。比如, 在新西兰的一些水域中检测到P. pungens可产毒, 但同时却在新西兰其他水域中发现了该种的无毒株系, 然而, 上述研究只是鉴定到种的水平, 并未详细说明其种下分类学信息(Rhodes et al, 1996)。到目前为止, 在中国尚无拟菱形藻引发中毒事件的相关报道。李爱峰(2005)曾在长江口海域分离一株尖刺拟菱形藻, 但并未检测到多莫酸。杨军霞(2007)曾检测了东海长江口、厦门港胡里山、海南不同地理株系的尖刺拟菱形藻, 以及在不同条件下诱导尖刺拟菱形藻株系产毒, 也未检出多莫酸。但以往检测的株系较少, 数据积累有限, 目前尚不能下定论。本文鉴定的尖刺拟菱形藻原变种P. pungens var. pungens和尖刺拟菱形藻阿维罗变种P. pungens var. averiensis没有检测到DA, 那么尖刺拟菱形藻的产毒特征与3个变种之间是否存在直接联系, 目前尚不明确。
随着研究的深入, 发现拟菱形藻不同株系的产毒水平存在较大差异, 可能与不同环境条件有关, 包括物理因素、生物因素及营养水平等(Lelong et al, 2012)。以往研究较多聚焦于不同营养因子对拟菱形藻产毒水平的影响, 如硅、氮、磷、光照与生长周期等。Bates等(1991)发现低硅起始浓度可以促使多列拟菱形藻(P. multiseries)在稳定期产生更多的DA。另外, 该研究还发现氮缺乏会导致多列拟菱形藻无法继续产生DA, 当添加氮元素后, 又恢复DA合成能力。Lundholm等(1994)发现多列拟菱形藻(P. seriata)的产毒水平与细胞生长周期相关, 稳定期产毒水平最高。Fehling等(2005)也报道了多列拟菱形藻在长日照条件下的产毒能力显著提高。近年研究开始关注生物因素的影响, 如浮游动物摄食对于拟菱形藻产毒水平的影响。Tammilehto等(2015)发现桡足类(Calanus copepodites)可显著提高成列拟菱形藻的产毒水平, 随着DA水平的提高, 成列拟菱形藻的被捕食率明显降低。同时该研究还发现桡足类的刺激作用并不是通过与藻细胞直接接触而实现的, 而应该是通过释放的某种化学物质来完成, 但化学物质的具体成分尚不明确。

The authors have declared that no competing interests exist.

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