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Journal of Tropical Oceanography >

2018 , Vol. 37 >Issue 2: 26 - 35

DOI: https://doi.org/10.11978/2017053

Orginal Article

Nucleic acid proxies for ingestion rate, growth and reproduction in copepod Pseudodiaptomus annandalei

  • HE Xuejia , 1 ,
  • YANG Huaming 1 ,
  • LYU Baidong 2 ,
  • YIN Jianqiang 3
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  • 1. Key Laboratory of Eutrophication and Red Tide Prevention of Guangdong Higher Education Institutes, Research Center of Harmful Algae and Marine Biology, Jinan University, Guangzhou 510632, China
  • 2. Guangzhou College of Technology and Business, Guangzhou 333300, China
  • 3. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
Corresponding author: HE Xuejia. E-mail:

Received date: 2017-05-12

  Request revised date: 2017-06-26

  Online published: 2018-04-11

Supported by

National Natural Science Foundation of China (41276153, 41176087)

Joint Project of National Nature Science Foundation of China-Guangdong (U1301235)

Open Fund Project of Key Laboratory of Sustainable Utilization of Marine Biological Resources of Chinese Academy of Sciences (LMB111008)

Copyright

热带海洋学报编辑部
Fold

Abstract

Nucleic acid indices can indicate nutrition status and growth of copepods; yet, lack of comparison among different phylogenetic groups and indices constrains application of nucleic acid proxies in field investigation. In this study, ingestion rate, growth rate of copepodid at Stage Ⅱ and egg production rate were studied in brackish copepod Pseudodiaptomus annandalei at different food levels (0.2~2.0 μg C·mL-1). Biochemical indices including mass specific RNA content, DNA content, RNA:DNA, and RNA: protein ratios, as well as elemental composition (mass specific phosphorus content, nitrogen content, atomic C:P, and C:N ratios ), were also measured and described. Ingestion rate, growth rate, egg production rate, and RNA-related indices in copepodids increased with increasing food level hyperbolically, so did RNA:DNA ratio in female adults. Ingestion and growth rates were significantly correlated with RNA-related indices in copepodids in a linear manner and the strength of correlation ranked as RNA:DNA>RNA:PRO>RNA content. Egg production rate, however, was correlated with RNA:DNA and RNA:PRO ratios in female adults with high and moderate significance, respectively. Our results suggested that RNA:PRO ratio is suitable to be an indicator of growth and reproduction rate in copepod besides RNA:DNA ratio and RNA content, which have been applied in field investigation. However, RNA:DNA as proxy of somatic growth should be confined to the same-aged copepod. In addition, the finding of hyperbolic correlation between RNA-related indices and food concentration implied that they may help prediction of food environment for copepod, but may be confined to food levels at unsaturated phase of functional responses of variables.

Key words： nucleic acid indicators; copepod; ingestion; somatic growth; reproduction

Cite this article

HE Xuejia , YANG Huaming , LYU Baidong , YIN Jianqiang . Nucleic acid proxies for ingestion rate, growth and reproduction in copepod Pseudodiaptomus annandalei[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2018 , 37(2) : 26 -35 . DOI: 10.11978/2017053

准确测定现场海洋生物的个体及种群的营养、生理和生长状态是海洋生理生态学领域的挑战之一, 对于桡足类等个体较小的种类尤其如此。生化标志物的出现及应用不仅避免了传统直接测量方法耗时耗力的缺点, 还提高了测量的精确度和重复性, 因此, 目前已有大量研究致力于寻求可靠且精确的生化标志物, 以指示海洋生物的营养和生长状况。核酸物质具备成为标志物的潜力。RNA总量主要反映了与蛋白质合成相关的细胞核糖体个数, 而DNA总量是半稳定的, 与细胞数目成正比, 因此RNA:DNA比值可以表征单个细胞RNA含量的多寡。RNA与蛋白质比值(以下简写为RNA:PRO)与一定量细胞的核糖体数目成正比, 可表征细胞质中核糖体的浓度(Bremer et al,1996)。这些与蛋白质合成相关的核酸指标可直接表征蛋白质合成速率, 因此可反映个体的代谢、营养状态和生长速率(体生长或生殖率)等。核酸标志物自提出至今已经在现场微生物群落、鱼类或养殖区贝类等调查中得到较广泛应用(Dahlhoff, 2004), 成为现场或养殖区调查的重要手段之一, 但在海洋浮游食物网中重要的功能群体——浮游桡足类中的研究则滞后得多。早期研究主要关注核酸组分与体生长之间的功能关系(Dagg et al, 1972; Båmstedt et al, 1980), 到20世纪80年代, RNA:DNA比值才被作为标志物进行研究, 直至90年代, 核酸指标与产卵率之间的相关性才开始受到重视。近年来, 荧光技术等方法的发展使海洋生物幼体和桡足类等小型海洋生物个体水平的核酸含量可被精确测定, 推动了核酸标志物的进一步开发和应用。
核酸指标中的RNA含量及RNA:DNA比值通常被认为是桡足类产卵率的良好指示物, 但核酸标志物的应用却在物种、分布地域等方面具有特异性。即便是同属物种, 其适合的核酸标志物种类也可能存在差异。例如, Gusmão等(2011)研究显示, 对于Acartia sinjiensis来说, RNA:DNA比值与RNA相对含量可作为蚤体生殖力的标志物; 而对A. gruni和A.bifilosa来说, RNA相对含量(RNA︰干重)是产卵率的优质指标。不过, 已有的核酸标志物研究所涉及的桡足类种类还相当有限, 开展更多物种的核酸标志物研究及进行物种间的比较极为必要。
核酸指标RNA:PRO比值作为标志物较晚才被提出, 相关研究很少。在Wagner等(2001) 对飞马哲水蚤Calanus finmarchicus, 以及Holmborn等(2009)对双刺纺锤水蚤Acartia bifilosa的研究中, RNA:PRO比值分别与体生长率和产卵率呈现极显著线性相关性。近期何学佳 等(2015)对桡足类安氏伪镖水蚤的研究显示, RNA:PRO比值与体生长率之间存在显著的线性相关性, 并且不受发育阶段的限制。纵观桡足类核酸标志物的研究, 可以发现, 其中涉及的桡足类种类大多为自由产卵型物种, 虽有涉及携带卵囊型物种, 但仅限于安氏伪镖水蚤和Oithona davisae(Yebra et al, 2011)。而且, 携带卵囊型桡足类中核酸指标与产卵率之间的相关性至今未见报道。此外, 我国的桡足类核酸标志物的研究较为稀缺, 近年才有零星报道出现(Ning et al, 2013; 宁娟 等, 2013; 何学佳 等, 2015), 相关研究还亟待开展。
安氏伪镖水蚤Pseudodiaptomus annandalei分布于印度洋及太平洋沿岸, 是我国东南沿海常见咸淡水浮游桡足类。本研究选择安氏伪镖水蚤作为研究对象, 在不同的饵料浓度喂食的条件下, 测定其桡足幼体的摄食率、生长率及成体产卵率, 同时测定核酸指标和元素组成, 并通过对核酸指标与生理指标之间的相关性分析, 寻找可灵敏指示桡足类生理状态的指标, 为核酸标志物在桡足类现场调查中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物材料的采集与处理

安氏伪镖水蚤采集于深圳红树林近岸(22°31′24″N, 113°59′44″E, 水温20℃, 盐度18‰)。在实验室用天然海水和人工海水成功驯化, 培养时间超过5年。培养光照强度为12.5μmol·m-2·s-1, 光周期为L:D = 12h:12h, 温度为20±1℃, 盐度为25‰,每日投喂柔弱角毛藻Chaetoceros debilis和中肋骨条藻Skeletonema costatum的混合饵料。实验所用饵料为柔弱角毛藻。饵料藻以f/2培养基在光照度5000lx、光周期L:D= 12h:12h、温度20±1℃的条件下培养至指数期(~7d), 离心收集(2000rpm, 10min)。水蚤培养盐度为25‰, 温度为20℃。

1.2 安氏伪镖水蚤桡足幼体的生长率测定

挑选桡足幼体Ⅱ期安氏伪镖水蚤150只, 均分至15个装有50mL人工海水的100mL烧杯中。用柔弱角毛藻喂食, 初始食物浓度调节至0.13、0.26、0.52、1.04和2.08μg C·mL-1(对应的藻细胞密度分别为0.5、1、2、4和8×104cells·mL-1), 每个食物浓度组设3个平行。每天投喂饵料一次, 培养时间为3d。在有刻度尺的解剖镜下观察桡足幼体在培养初始和结束时的体长。运用公式g = [ln(lt)-ln(l0)] / t 计算桡足幼体的比生长速率, 其中t表示培养天数, l0表示水蚤初始体长, lt表示培养t天后水蚤的体长。

1.3 安氏伪镖水蚤摄食率的测定

挑选桡足幼体Ⅱ期安氏伪镖水蚤250只, 平均置于25个盛有50mL人工海水的50mL聚乙烯离心管中。添加柔弱角毛藻作为饵料, 调节初始食物浓度至0.13、0.26、0.52、1.04和2.08μg C·mL-1。每个食物浓度组5个平行。每个浓度组另设仅含藻细胞的人工海水作为对照。离心管密闭后固定在转速为1rpm的浮游动物转轮于暗环境中, 培养时间为24h。0和24h取水样2mL, 用鲁格试剂固定, 随后在显微镜下用浮游植物计数框对初始和结束时藻细胞密度进行计数。然后根据公式(1)(Frost, 1972)计算摄食率(ingestion rate, IR):
$IR=\frac{V \cdot (lnC_{t}-linC_{tf}) \cdot (C_{th}-C_0)} {N \cdot (ln C_{tf}-ln C_0)\cdot t}$
其中, V表示培养海水的体积, N表示桡足类的数量, C0和Ctf分别表示实验前、后的藻细胞密度, Ct表示对照组中实验结束时的藻细胞密度, t表示培养时间。

1.4 安氏伪镖水蚤的产卵率测定

挑取50只成熟雌性个体, 在解剖镜下用解剖针小心拔除卵囊, 另挑取成熟雄性个体50只, 雌性成对分置于50个盛有10mL人工海水的20mL烧杯中。添加饵料柔弱角毛藻, 初始食物浓度为0.13、0.26、0.52、1.04和2.08μg C·mL-1, 每个浓度组10个平行。每隔12h补充饵料以保持饵料浓度不变。3d后在显微镜下对幼体数及雌体携卵数进行计数, 计数总和视为后代总数。

1.5 安氏伪镖水蚤核酸和蛋白质的精确定量

在与1.2和1.4同样的条件下培养水蚤, 但每个平行烧杯的动物个体数增至 25只, 培养体积仍为每只桡足幼体Ⅱ期或成体水蚤10mL人工海水。3天后, 分别收集桡足幼体及成体。每个烧杯挑出3只水蚤, 用无菌人工海水冲洗后, 收集于装有1mL RNA later溶液的1.5mL离心管中。每个生长阶段设3个平行样, 每个样品包含3只桡足幼体或成体。成体事先在显微镜下用解剖针小心拔除卵囊。在无菌环境中, 经DNA/RNA Isolation Kit(TIANGEN)分别提取RNA和DNA后, 取出100μL 核酸溶液与等体积的荧光颜料工作液于黑色的96孔微孔板中混匀(R11490 Quant-It RiboGreen RNA Assay Kit,P7589 Quant-It PicoGreen dsDNA Assay Kit, Invitrogen), 混合溶液常温孵育5min 后用多功能荧光酶标仪(SAFIRE ii-BASIC, Tecan Austria GmbH)于激发波长485nm、发射波长535nm处测定荧光值。标准曲线的制作采用购买的RNA (calf-liver, 18S and 28S, Sigma R0889)和DNA (calf-thymus, Sigma D4764)标准品, RNA标准浓度设置为0、250、500、1000和1500ng·mL-1, 而DNA标准浓度设置为0、25、50、100和200ng·mL-1。
从每个烧杯中挑出5个桡足幼体或成体, 成体在显微镜下用解剖针小心拔除卵囊, 分别置于1.5mL离心管用于蛋白质的定量。每个阶段设3个平行样, 每个样品包含5只水蚤。样品经裂解液处理并研磨后稀释3倍, 取其中25μL稀释液于96孔微孔板中与200μL的BCA工作液(TIANGEN)混匀并37℃孵育30min, 冷却至室温, 用紫外酶标仪(VERSA Max, Molecular Devices)测定在562nm处的吸光值。

1.6 安氏伪镖水蚤元素组成的测定

将1.5培养的水蚤中的剩余个体以低气压过滤于GF/F膜(预先经480℃煅烧2h)上, 每个样品15只个体, 每个生长阶段设3个平行样。按照Solorzano等(1980)方法进行蚤体颗粒磷的测定, 使用紫外—可见分光光度计(U-4600, HITACHI)检测。
用与1.5同样的方法培养安氏伪镖水蚤, 按上述方法收集于GF/F膜, 成体收集前事先用解剖针小心拔除卵囊, 但过滤时用数滴0.5mol·L-1的甲酸铵冲洗样品脱盐。每个样品分别包含30只桡足幼体或成体。同一生长阶段3个平行样。样品置于烘箱中, 于60℃经48h烘干。取出后首先置于分析天平(XR205SM-DR, Precisa)测取水蚤干重, 然后用CNH 元素分析仪(Series Ⅱ CHNS/OAnalyzer, Perkin Elmer Instruments) 测定蚤体的C和N含量。

1.7 数据统计和回归分析

运用One-way ANOVA 对不同饵料浓度条件下培养的水蚤的摄食率、生长率、产卵率、生化组分及元素含量进行差异性分析, 对于经过方差齐性检验后方差不齐的部分数据, 运用非参数Mann- Whitney U检验分析差异性; 运用Pearson及线性回归分析分析生化指标与生长速率及产卵率之间的相关性。所用统计软件为SPSS 17.0。
运用公式(2)的双曲线模型对安氏伪镖水蚤的生理参数、生化及元素组分及比值随饵料浓度梯度的变化进行回归, 分析各参数及指标与饵料浓度之间的相关性。
$y=y_{max}(1-e^{-b(f-c)})$
其中y代表响应变量, e代表自然对数的底数, ymax代表响应变量的理论最大值, b、f和c为模型常数。

2 结果

2.1 摄食率、生长率及产卵率对饵料浓度变化的响应

如图1所示, 安氏伪镖水蚤桡足幼体的摄食率、生长率及雌性成体的产卵率随着饵料浓度梯度持续增加, 在次高浓度 1.04μg C·mL-1处趋于饱和状态, 最高和次高饵料浓度组水蚤的各生理参数之间无显著差异(p=0.56、0.73和0.77; 单因素方差分析和Tukey两两检测, p<0.05)。所有生理参数与饵料浓度均符合公式(2)所示的双曲线关系(表1), 且r≥0.95, 呈现极强的相关性。经计算, 幼体的摄食率、生长率及雌性成体的产卵率达最大值ymax(分别为0.053μg C·ind-1·h-1、0.16d-1和6.8eggs·ind-1·d-1)所需的饵料浓度接近实验所设定的次高浓度1.04μg C·mL-1。
Fig. 1 Physiological variables of P. annandalei in response to food concentration

图1 不同饵料浓度条件下安氏伪镖水蚤桡足Ⅱ期个体及雌性成体的生长代谢指标

进一步运用公式: 毛生长效率(gross growth efficiency)=生长率/摄食率, 计算出桡足幼体Ⅱ期个体的毛生长效率, 如图1d所示。在研究的饵料浓度范围内, 水蚤的毛生长效率为0.09±0.03~0.14±0.04范围, 各处理组间无显著差异性[p>0.05; 单因素方差分析和Tukey两两检测(One-way ANOVA and Tukey post-hoc test)]。

2.2 不同饵料浓度下安氏伪镖水蚤的核酸相关指标

测定蚤体 RNA、DNA和蛋白质的质量, 计算出RNA含量、DNA含量、RNA︰DNA、RNA︰PRO及 DNA︰PRO等5种核酸指标(图2、3)。
桡足幼体的RNA含量和RNA: PRO比值随着饵料浓度梯度起初显著增加, 然后增幅渐趋平缓, 在中浓度0.52μg C·mL-1处基本达饱和状态, 中浓度组和两个高浓度组之间无显著差异(p>0.05; 单因素方差分析和Tukey两两检测)。二者与饵料浓度的关系均符合公式(2)的双曲线关系(p<0.01, r=0.97; 表1), 饵料浓度为0.52μg C·mL-1时的实测值为预测最大值的99%。DNA含量在0.007±0.001~0.009±0.001μg·μg-1之间变化, 随饵料浓度梯度虽呈现先激增后缓慢减少的趋势, 但并无显著性差异(p=0.252; 单因素方差分析和Tukey两两检测); DNA:PRO比值延续了DNA含量的变化趋势, 除最高值(0.017±0.002μg·μg-1)与最低值(0.011±0.001μg·μg-1)存在显著差异(p=0.021; 单因素方差分析和Tukey两两检测)之外, 其他浓度组并无差别。RNA:DNA比值的变化则是显著性地持续增加, 最高值12.6±0.9出现在最高浓度组(p<0.01; 单因素方差分析和Tukey两两检测), 并且符合公式(2)的双曲线关系(p<0.01, r=0.96; 图2b, 表1)。
Fig. 2 Biochemical variables of P. annandalei at copedite Stage Ⅱ in reponse to food concentration

图2 不同饵料浓度条件下安氏伪镖水蚤桡足Ⅱ期个体的生化组分
DW指干重, 下同

Fig. 3 Biochemical variables of female P. annandalei in response to food concentration

图3 不同饵料浓度条件下安氏伪镖水蚤桡足雌性成体的生化组分

Tab. 1 Analysis of functional responses of physiological variables, biochemical and elemental compositions to food concentration in P. annandalei using a hyperbolic equation

表1 安氏伪镖水蚤的生理参数、生化及元素组成对饵料浓度的响应的双曲线模型[y=ymax(1-e-b(f+c))]回归分析

生长阶段 指标 ymax b c r p
桡足幼体 摄食率 0.053±0.006 2.04±0.62 0 0.95 0.012
生长率 0.16±0.0053 3.3±0.34 0 0.99 0.001
RNA:干重 0.083±0.0019 8.1±0.85 0 0.97 0.0054
RNA:PRO 0.14±0.0008 11±0.37 0 0.99 <0.001
RNA:DNA 15±3.3 0.56±0.38 1.1±0.56 0.96 <0.01
雌性成体 产卵率 6.8±0.34 2.6±0.38 0 0.99 <0.01
RNA:DNA 15±0.26 2.6±0.82 0.56±0.20 0.97 <0.001
C:P 434±15 7.7±1.2 0 0.95 0.015
雌性成体RNA含量变化范围为0.031±0.001~ 0.039±0.005μg·μg-1, 随饵料浓度梯度逐渐减少, 然后趋于平稳; RNA:PRO比值变化幅度较小, 呈阶段性变化, 低饵料浓度组的比值显著低于高饵料浓度组(p<0.05; Mann-Whitney test; 图3)。DNA含量随饵料浓度梯度逐渐减小, 最高值为0.003± 0.0003μg·μg-1; DNA:PRO比值则呈先减小后增加的趋势, 最低比值为0.006±0.0003(p=0.035; 单因素方差分析和Tukey两两检测), 其余浓度组比值并无差异。RNA:DNA比值的变化范围是12.9±0.3~ 15.5±0.7μg·μg-1, 与饵料浓度相关性符合公式(2)所示的双曲线关系(p<0.001, r=0.97; 图3b, 表1), 在0.52μg C·mL-1处实测比值为预测最大比值的99%, 接近饱和状态。

2.3 不同饵料浓度下安氏伪镖水蚤的化学计量学特征

通过测定水蚤的碳、氮和磷含量, 计算了蚤体的磷和氮干重含量(%)、C︰P摩尔比值和C︰N摩尔比值等化学计量学特征值。如图4所示, 不同饵料浓度组的桡足幼体的化学计量学特征值均无明显差异(p>0.1; 单因素方差分析和Tukey两两检测)。雌性成体的化学计量学元素组成在不同的饵料浓度组之间存在差异。磷干重含量的变化范围为0.17%(±0.02%)~0.27%(±0.03%), 随着饵料浓度梯度递减, 在0.52μg C·mL-1处减幅变缓。C:P摩尔比值随饵料浓度的变化趋势与磷干重含量相反, 从291±31持续递增至464±44, 是唯一符合双曲线关系的特征值(p=0.015, r=0.95; 表1, 图5c), 次高饵料浓度处的实测比值接近公式预测最大比值, 显示次高饵料浓度接近饱和浓度。最高饵料浓度组的雌性个体的氮干重含量高于其余浓度组的个体, 但并不显著, 其C:N摩尔比值则显著低于其余浓度组个体(p<0.05; 单因素方差分析和Tukey两两检测), 其余饵料浓度组个体之间的氮干重含量及C:N摩尔比值差异不大(图5)。
Fig. 4 Elemental composition of P. annandalei at copepodite StageⅡin response to food concentration

图4 不同饵料浓度条件下安氏伪镖水蚤桡足Ⅱ期幼体的元素组成

Fig. 5 Elemental composition of female P. annandalei in response to food concentration

图5 不同饵料浓度条件下安氏伪镖水蚤雌性成体的元素组成

2.4 相关性分析

就不同饵料浓度下的各个生长阶段的RNA相关指标和各生理指标之间的相关性作了Pearson分析, 结果显示, 桡足幼体的RNA含量、RNA:DNA比值及RNA:PRO比值普遍与生长率和摄食率具有正相关线性关系, 与生长率的正相关关系均为极显著, 与摄食率具有极显著正相关关系的指标仅限于后两项指标; 雌性个体的RNA:DNA及RNA:PRO比值与产卵率呈正相关线性关系, 其中RNA:DNA比值与产卵率的相关性具极显著性(表2)。
就不同饵料浓度下的桡足幼体和雌性成体的化学计量学特征值和生长率及产卵率之间的相关性作了Pearson分析, 结果显示, 桡足幼体的磷、氮干重含量及C:P、C:N比值与生长率及摄食率并无相关性; 对雌性个体而言, 磷干重含量与产卵率呈极显著负相关线性关系, 而C:P比值与之呈极显著正相关, 氮干重含量及C:N比值与产卵率无相关性(表2)。
Tab. 2 Analysis of correlations between physiological parameters (ingestion rate, growth rate, and egg production rate) and nucleic acid indices as well as elemental compositions in P. annandalei at different food levels

表2 安氏伪镖水蚤蚤体生理指标(摄食率、生长率和产卵率)与核酸指标及元素组成的相关性分析

生长阶段 生理指标 核酸指标和元素组成 Pearson分析 y=ax+b
p r a b
桡足Ⅱ期 摄食率 RNA︰干重 0.018* 0.725 0.454 0.065
RNA︰DNA 0.000** 0.953 114.8 6.956
RNA︰PRO 0.003** 0.836 3.815 -0.029
P含量/% 0.509 0.237 -0.443 0.320
N含量/% 0.797 0.093 1.05 3.957
C:P 0.510 0.237 155.1 103.5
C:N 0.857 0.066 -1.461 8.327
桡足Ⅱ期 生长率 RNA︰干重 0.005** 0.688 0.165 0.074
RNA︰DNA 0.000** 0.814 39.60 4.942
RNA︰PRO 0.004** 0.702 1.118 -0.064
P含量/% 0.419 0.225 0.158 0.281
N含量/% 0.307 0.238 1.212 3.812
C:P 0.503 0.187 -48.443 116.13
C:N 0.528 0.178 -1.515 8.514
雌性成体 产卵率 RNA︰干重 0.076 0.636 0.039 -0.001
RNA︰DNA 0.000** 0.851 0.511 11.71
RNA︰PRO 0.027* 0.565 3.815 -0.029
P含量/% 0.000** 0.891 -0.019 0.303
N含量/% 0.193 0.356 0.244 2.593
C:P 0.000** 0.889 12.29 88.81
C:N 0.132 0.408 -0.395 11.79

注: 回归分析中, y为核酸指标或化学计量学特征值, x为生理参数; *指显著, **指极显著

3 讨论

3.1 不同饵料浓度下安氏伪镖水蚤的生化和元素组成

本研究显示, 当饵料浓度增加10倍时, 安氏伪镖水蚤桡足Ⅱ期幼体的RNA含量、RNA:PRO比值及RNA:DNA比值显著增加29%~53%, 而雌性成体的RNA:PRO及RNA:DNA比值的增幅较小, 仅为21%~22%。Holmborn等(2009)的研究中, 饵料浓度在0~1.2μg C·mL-1范围内变化时, 双刺纺锤水蚤雌性成体RNA:PRO及RNA:DNA比值的差异为1.5~2倍。这两项研究中, RNA相关指标随饵料浓度的变化均符合双曲线模型, 对于安氏伪镖水蚤雌性成体, 仅限于RNA:DNA比值。但并非所有的桡足类物种的RNA核酸指标都会随喂食饵料浓度变化而变化。Kobari等(2017)的研究中, 对现场采集的多种桡足类CⅣ—CⅥ期的个体进行5天的饥饿处理, 令其RNA: DNA比值下降了16%~70%, 然而, 具有贮存脂类的物种的RNA:DNA比值几乎不受饥饿处理影响。Wagner等(2001) 对具有脂类贮备的飞马哲水蚤的研究也显示, 同一生长阶段的水蚤在不同饵料浓度喂食时RNA:DNA比值虽有差异, 但RNA:PRO比值基本保持一致。贮存脂类的存在似乎有助于食物环境变化时桡足类的核酸组成稳态的保持。相反, 对于诸如纺锤水蚤属及安氏伪镖水蚤等一类缺乏贮存脂类的物种(Dagg et al, 1972; Madhupratap et al, 1979), 其核酸组成会敏感、及时地响应食物环境的变化。因此, 桡足类是否具有贮存物质是决定桡足类核酸标志物能否实时指示现场食物环境的关键因素。
有别于核酸指标, 安氏伪镖水蚤桡足幼体在0.2~2.0μg C·mL-1饵料浓度范围内保持化学计量学稳态, 其个体碳、氮和磷的绝对含量、干重比含量以及元素比值基本不变。雌性成体与之不同, 其体磷干重比含量随着饵料浓度减小而缩减, C:P比值则逐渐增加。考察安氏伪镖水蚤的个体元素含量, 个体磷含量的差异仅存于最高、最低饵料浓度组之间, 个体碳含量却随着饵料浓度的增加而增加, 那么, 蚤体脂类以及碳水化合物的累积是导致磷干重比含量及C:P比值的变化的主要原因。经进一步分析发现, 安氏伪镖水蚤的磷干重含量与产卵率呈现线性负相关关系, 也表明饵料浓度的增加导致储备物质的增加。Ventura等(2005)研究发现, 处于生殖期的淡水桡足类Diaptomus cyaneus雌性成体的磷干重含量较非生殖期个体低, 而N:P和C:P比值高于后者, 他们认为这种变化源于雌性成体脂类和碳水化合物贮存量对干重的影响。本研究还发现, 雌性成体的C:N比值在最高浓度处有所降低, 可能原因是个体碳含量和氮含量同时增加, 但后者的增幅大于前者。桡足类的氮通常主要存在于较为稳定的结构性蛋白和几丁质当中, 但本研究中氮干重含量的增加是否涉及一些与生殖相关的特异蛋白质尚需进一步研究证实。

3.2 安氏伪镖水蚤核酸指标对体生长及生殖生长的指示

桡足类的核酸指标中最早受到较多关注的是RNA含量和RNA:DNA比值, 研究发现, 它们对环境温度、饵料浓度和饵料品质条件变化的响应与产卵率的响应具有良好的相关性, 因此可作为产卵率的标志物(Saiz et al, 1998; Gusmão et al, 2011)。另一核酸指标RNA:PRO比值对产卵率的潜在指示作用的研究则较为稀缺。本研究同时就包括RNA:PRO比值在内的一系列核酸指标与安氏伪镖水蚤的产卵率的相关性进行了比较, 结果表明, RNA:DNA及RNA:PRO比值可指示桡足类生殖生长, 但后者与产卵率的相关性弱于前者。根据本研究中产卵率与RNA:DNA比值的回归方程转换可得, 产卵率=2.0×RNA:DNA - 23.0, 斜率和截距处于另两种海洋桡足类Paracalanus sp.及Paracartia grani转换方程的斜率和截距范围(1.57~3.14和-29.6~ -5.52)内(Nakata et al, 1994; Saiz et al, 1998)。以往的研究中, 仅Holmborn等(2009)比较了RNA:PRO比值与其他核酸指标在表征产卵率方面的优劣。他们对双刺纺锤水蚤的研究首次显示, 除个体RNA含量以外, RNA:PRO比值也与产卵率密切相关, 相反, RNA:DNA比值与产卵率仅为弱相关。此外, 纵观桡足类生殖力的核酸标志物的研究, 无一例外地仅针对自由产卵的种类, 如纺锤水蚤属、哲水蚤属、近缘真宽水蚤Eurytemora affinis等, 而携卵型桡足类从未提及。本研究首次以携卵型桡足类为对象研究核酸标志物对其产卵率的指示。Hogfors等(2011)以汤氏纺锤水蚤Acartia tonsa为例提出, RNA含量可指示产卵率, 但无法指示桡足类的种群补充量。由自由产卵种类得出的结论可能并不适用于携卵型桡足类。自由产卵种类的卵孵化较易受环境条件的影响, 而携卵型种类与之不同, 卵产出后在卵囊中完成孵化, 虽耗时较长, 但母体保护使卵的孵化率几乎接近100%。事实上, 本研究中产卵率包括了卵囊中未完全孵化的卵和已释放出的幼体。因此, RNA相关指标应当可用于携卵型桡足类种群补充量的估算。
本研究中, 安氏伪镖水蚤桡足幼体中RNA相关指标与各生理参数普遍存在线性相关性, 且相关性的显著性顺序为RNA:DNA>RNA:PRO>RNA含量, 表明RNA相关核酸指标均可指示摄食率及生长率。迄今为止, 全面比较核酸指标对桡足类体生长率表征的研究并不多。Wagner等(2001)对连续培养的飞马哲水蚤各个生长阶段的RNA核酸指标及生长率进行了研究, 结果显示RNA:DNA比值与体生长速率的相关性具有生长阶段特异性, RNA:PRO比值与体生长率之间的显著相关性则不受生长阶段的限制。基于此, RNA:PRO比值具备指示飞马哲水蚤种群水平生长率的优势, 而RNA:DNA比值可经生长阶段和温度的修正后用于指示现场桡足类生长速率。本研究仅针对安氏伪镖水蚤桡足类幼体, 在同一生长阶段内, RNA:DNA与摄食率及生长率的极显著相关性, 这与Wagner等(2001)的研究结果一致。根据本研究中生长率与RNA:DNA比值的回归方程转换可得, 桡足幼体生长率=0.025×RNA:DNA-0.12, 这与Yebra等(2011)对长腹剑水蚤Oithona davisae桡足幼体研究所得的转换方程较为相似(生长率=0.024×RNA:DNA+4.18), 与早期Ota 等(1984)现场采集的太平洋哲水蚤的研究结果(斜率=0.0306~0.0407)差距则较大。种间差异和实验温度都可能影响RNA:DNA比值与生长率的转换关系, 长腹剑水蚤的受试温度为20~28℃, 与本研究所用的22℃接近, 而太平洋哲水蚤的受试温度为8℃和15℃。何学佳 等(2015)也证实了RNA:PRO比值作为安氏伪镖水蚤体生长率的标志物时不受生长阶段的限制。因此, 现场调查种群生长率时采用RNA:PRO指标更为合宜。由现场采集的安氏伪镖水蚤RNA:PRO及RNA:DNA比值来估算生长率及产卵率可采用何学佳 等(2015)及本研究提供的相关经验方程, 但环境温度与研究温度之间差异的存在与否, 决定了是否需要就温度对方程进行校正。因此, 有必要在可控条件下就温度如何影响安氏伪镖水蚤的核酸指示对生理参数的指示作用进行研究。
本研究发现RNA相关指标、摄食率或体生长率与饵料浓度的相关性普遍符合双曲线模型。这种功能性的响应当中, 饵料浓度为0.52~1.04μg C·mL-1处获得的各项指标均达到最大预测值的95%以上。比较生殖实验中的RNA:DNA比值、产卵率与饵料浓度之间的相关性, 也得到类似结果。事实上, 这种变化趋势的一致性是RNA相关指标可用于指征体生长率及产卵率的根本原因。Holmborn等(2009) 研究双刺纺锤水蚤时发现相似的情形, 其个体RNA含量等核酸指标、摄食率、产卵率普遍与饵料浓度呈现双曲线关系, 同时核酸指标与摄食率及产卵率之间几乎全部具有显著相关性。本研究中的RNA:PRO比值则属例外, 它与饵料浓度的关系虽不符合双曲线模型, 却仍与产卵率存在显著相关性, 这可能是由于在研究的饵料范围内其变化趋势与产卵率大致符合的原因, 但它们之间的相关性却弱于其他指标之间的线性关系。此外, 可以看出无论雌性成体或幼体的RNA:DNA比值与饵料浓度之间始终具有双曲线关系, 显示可以凭此指标来判断现场海区水蚤的饵料丰度情况, 但实际的运用中需要注意, 如果海区食物浓度超过了预期最大值时出现的浓度, 环境食物浓度可能会被低估; 此外, 海区多种饵料生物混杂导致了饵料品质与单一饵料不同, 也会影响指示的准确性。

4 结论

1) 安氏伪镖水蚤的RNA相关核酸指标随着饵料浓度变化而改变, 桡足幼体所有RNA相关指标、雌性成体的RNA:DNA比值及生理指标随饵料浓度的变化符合双曲线模型。
2) 桡足幼体的所有RNA相关指标普遍与摄食率及生长率呈显著线性相关性, 其中RNA:DNA比值与二者的相关性最强, 但RNA:PRO比值具有指示桡足类种群生长率的优势; RNA:DNA和RNA:PRO比值均与产卵率呈显著线性相关性, 后者与产卵率的相关性显著程度稍弱于前者, 根据携卵型桡足类核酸指标运用回归方程可同时估算其产卵率和种群的补充量。
3) 核酸指标与生理指标的对应关系受到环境温度的影响, 针对桡足类开展相关研究将有助于提高现场调查中核酸指标估测生理指标的准确度。

The authors have declared that no competing interests exist.

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