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Journal of Tropical Oceanography >

2018 , Vol. 37 >Issue 2: 55 - 62

DOI: https://doi.org/10.11978/2017049

Orginal Article

Analysis of physicochemical properties and structure characteristics of several crude algal polysaccharides

  • HOU Ping , 1 ,
  • MA Jun 2, 3 ,
  • CHEN Yan 2, 3 ,
  • PEI Zhisheng 3 ,
  • ZHAO Jing 3 ,
  • YE Xipeng 3 ,
  • JIANG Fangyan 2, 3 ,
  • HUANG Hai , 2, 3
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  • 1. Sanya Aviation and Tourism College, Sanya 572000, China
  • 2. Hainan Key Laboratory for Conservation and Utilization of Tropical Marine Fishery Resources, Sanya 572022, China
  • 3. College of Life Science and Ecology, Hainan Tropical Ocean University, Sanya 572022, China
Corresponding author: HUANG Hai. E-mail:

Received date: 2017-04-26

  Request revised date: 2017-07-18

  Online published: 2018-04-11

Supported by

Hainan Province Natural Science Foundation (20153162, 20163071, 20163074)

Copyright

热带海洋学报编辑部
Fold

Abstract

The monosaccharide composition, functional groups and molecular weight of five crude algal polysaccharides were analyzed by using fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), gas chromatography (GC) and gel permeation chromatography (GPC). The results showed that five crude algal polysaccharides contained both xylose and fucose. Padina australis polysaccharide, which was the high molecular weight uniformity-polysaccharide, contained the rich sorbitol, whereas Ulva lactuca polysaccharide had a wide molecular weight distribution and was the poor uniformity-polysaccharide. The analysis of FTIR indicated that five crude polysaccharides were both acidic polysaccharides. Caulerpa sertularioides, Sargassum polycystum and Betaphycus gelatinum polysaccharide had obvious absorption peak of sulfate group. The structure of Betaphycus gelatinum polysaccharide included furanose and pyranose, and the glycosidic bond might include beta and alpha types. The sulfate content of Padina australis polysaccharide was 38.43% (±2.38%), which was significantly higher than that of the other kinds of algal polysaccharides, whereas the sulfate content of Caulerpa sertularioides polysaccharide was only 8.92%(±1.04%).

Key words： algal polysaccharide; component; structure; molecular weight; sulfate group

Cite this article

HOU Ping , MA Jun , CHEN Yan , PEI Zhisheng , ZHAO Jing , YE Xipeng , JIANG Fangyan , HUANG Hai . Analysis of physicochemical properties and structure characteristics of several crude algal polysaccharides[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2018 , 37(2) : 55 -62 . DOI: 10.11978/2017049

海藻是海洋生物资源的重要组成部分, 主要分为蓝藻、绿藻、红藻和褐藻四大类。我国海岸线长, 浅海面积较大, 海藻种类较为丰富, 已记录800种左右(黄宗国, 2008), 其中已被利用的主要经济海藻约40种, 《中国海洋药物词典》收录的藻类药物125种(姜凤吾 等, 1994; 张兴德 等, 2003)。海藻中含有丰富的多糖, 约占海藻干重的50%以上, 是海洋多糖开发的重要资源之一。越来越多的研究表明, 海藻多糖具有明显的抗氧化(Chew et al, 2008; Vijayabaskar et al, 2012)、抗病毒(Schaeffer et al, 2000; 张赛金 等, 2003; Damonte et al, 2004)、抗凝血(Pereira et al, 2002; 王静凤 等,2003)、抗肿瘤(李德远 等, 2002; Koyanagi et al, 2003)等生物学功效, 已成为近年来研究开发的热点之一(陈洪亮 等, 2002; 司玫 等, 2003)。
多糖是由不同类型和数目的单糖通过糖苷键按照一定的顺序连接形成的复杂生物大分子。一些研究表明海藻多糖的生物活性与单糖类型、组成结构及硫酸化程度密切相关。Matsubara(2004)发现绿藻多糖的硫酸阿拉伯聚糖或硫酸鼠李聚糖可作为内生抑制剂, 用于抑制凝血酶的活性。Lee等(1999)研究发现从礁膜Monostroma latissimum中提取的一种硫酸鼠李聚糖能够明显抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus type-Ⅰ, HSV-1)、人细胞巨化病毒(human cytomegalovirus, HCMV)以及人免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type-Ⅰ, HIV-1)的复制。Yu等(2003)研究发现低分子量的孔石莼(Ulva pertusa)多糖能显著性降低小鼠血清中甘油三酯的含量。此外, Qi等(2005)研究发现高硫酸化修饰的孔石莼多糖比天然多糖能更好地清除羟自由基, 并具有更强的还原能力。
目前, 关于海藻多糖组成及结构的研究还相对少见, 并且多数仅针对一种海藻多糖进行研究, 而关于不同属种海藻多糖的结构差异与效应关系的比较研究存在一定的空白, 这妨碍了海藻多糖的进一步开发和利用。因此, 本研究针对几种隶属于红藻门、褐藻门和绿藻门的海藻多糖进行单糖组成、分子量、硫酸基团及官能团的比较研究, 旨在探讨不同类型海藻多糖的组成及其结构差异, 这对于进一步分析海藻多糖的生物学活性具有重要的理论价值。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所使用的海藻为孔石莼Ulva lactuca、棒叶蕨藻Caulerpa sertularioides、匍枝马尾藻Sargassum crassifolium、南方团扇藻Padina australis和琼枝麒麟菜Betaphycus gelatinum, 均由本实验室收集并保存。

1.2 仪器与试剂

主要仪器: 3101PC型UV-Vis扫描分光光度计(日本岛津), RE3000-A型旋转蒸发仪(上海亚荣), IR-960型傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津), 冷冻真空干燥器(北京四环), Trace1300型气相色谱(美国Thermo), LC20凝胶色谱仪(日本岛津)。
主要试剂: D-甘露糖(D-Man)、D-半乳糖(D-Gal)、L-岩藻糖(L-Fuc)、D-葡萄糖醛酸(D-Glc uA)、L-鼠李糖(L-Rha)、D-木糖(D-Xyl)、D-阿拉伯糖(D-Ara)、L-山梨糖(L-Sor)。

1.3 实验方法

1.3.1 多糖的提取
称取每种海藻粉各10g, 加水40~60倍, 于80℃水浴中提取2次, 过滤后合并滤液, 浓缩滤液至三分之一体积后, 加入Sevage试剂(张萍 等, 2013)除蛋白2次, 10000×g离心10min, 小心吸取上清液, 浓缩上清液至三分之一体积后, 加无水乙醇至终体积分数为75%, 醇沉过夜, 4℃, 10000×g离心10min, 弃上清, 沉淀冷冻干燥, 得海藻粗多糖样品。孔石莼多糖简称UlPS、棒叶蕨藻多糖简称CaPS、匍枝马尾藻多糖简称SaPS、南方团扇藻多糖简称PaPS、琼枝麒麟菜多糖简称BePS。
1.3.2 紫外光谱分析
参考李东霞等(李东霞 等, 2002)试验方法, 在190~600nm波长范围内对几种多糖溶液进行紫外扫描, 主要观察260和280nm处多糖水溶液的吸收情况。
1.3.3 单糖组成分析
参照白娣斯 等(2011)方法, 称取样品500mg进行水解, 加2mol·L-1的三氟乙酸100mL, 120℃水解5h, N2吹干。称取各样品水解物20mg于比色管中, 加入盐酸羟胺10mg和0.5mL的无水吡啶, 90℃水浴振荡30min, 冷却至室温, 再加入0.5mL无水醋酸酐, 继续90℃水浴30min, N2吹干, 得到单糖的糖腈乙酸酯衍生物。
色谱条件: 毛细管管柱(Rtx-1, 30m×0.25mm× 0.25μm), 进样量1μL。
程序升温: 初始柱温为70℃, 保持2min, 以20℃·min-1升至180℃, 保持5.5min, 以3℃·min-1升至250℃, 保持20min; 进样口温度为250℃, 检测器温度为250℃。
1.3.4 多糖的结构分析
参考徐健 等(2011)方法, 取干燥的多糖2.0mg, 与干燥的KBr粉末混合压成透明薄片, 在4000~400cm-1的范围内进行傅立叶变换红外光谱扫描分析。
1.3.5 多糖分子量分析
参考赵峡 等(2000)方法, 采用TSKgel GMPWXL色谱柱, 流动相为0.1mol·L-1的NaNO3溶液, 流速0.6mL·min-1, 柱温35℃, 进样量20μL, 示差折光检测器(refractive index detector, RID)检测。
1.3.6 多糖硫酸基团含量测定
参考丛建波 等(2003)方法, 精确称取多糖样品3.0mg, 以1mol·L-1的HCl作溶剂, 配制浓度为1.5mg·mL-1的多糖样品液, 封管后在100℃下加热水解3h, 冷却后分别吸取0.6mL的水解液, 加入9.0mL的三氯乙酸(3%, V/V)和2.4mL的明胶—氯化钡溶液, 混合后在室温下静置20min, 以1mol·L-1的HCl做空白对照, 在波长360nm下测吸光值, 并根据标准曲线计算不同海藻多糖的硫酸基团含量。

1.4 数据处理

数据分析采用SPSS17.0软件进行, 结果用平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 紫外光谱扫描分析

在紫外光谱190~600nm波长范围内对几种海藻粗多糖溶液进行紫外扫描, 结果显示5种多糖均在小于200nm处有糖类化合物的强吸收峰, PaPS、SaPS、CaPS和UlPS等4种多糖在260nm处有明显特征吸收峰, 这说明这几种粗多糖含有一定量的核酸。280nm处并无明显的吸收峰(图1), 说明Sevag法对海藻多糖的蛋白清除效果较好。BePS在260和280nm处无明显吸收峰, 提示该多糖的核酸及蛋白质含量极低。
Fig. 1 Ultraviolet(UV) scanning of five crude algal polysaccharide

图1 5种海藻粗多糖的紫外光谱扫描分析

2.2 气相色谱分析

标准单糖经糖腈乙酸酯衍生化后, 利用气相色谱(gas chromatography, GC)进行检测分析, 结果如图2示。各标准单糖出峰顺序和保留时间分别为: D-葡萄糖醛酸(D-Glc UA, 6.995min)、L-鼠李糖(L-Rha, 8.883min)、D-阿拉伯糖(D-Ara, 9.01min)、D-木糖(D-Xyl, 9.125min)、D-甘露糖(D-Man, 11.392min)、L-岩藻糖(L-Fuc, 11.598min)、D-半乳糖(D-Gal, 11.905min)及L-山梨糖(L-Sor, 13.945min)。
Fig. 2 GC chromatogram of complex monosaccharide derivative

图2 混合单糖标准品的气相色谱图
1. D-葡萄糖醛酸(D-Glc UA); 2. L-鼠李糖(L-Rha); 3. D-阿拉伯糖(D-Ara); 4. D-木糖(D-Xyl);5. D-甘露糖(D-Man); 6. L-岩藻糖(L-Fuc); 7. D-半乳糖(D-Gal); 8. L-山梨糖(L-Sor)

图3为5种海藻粗多糖的气相色谱图, 对比混合单糖标准品的色谱图(图2)可知, UlPS由鼠李糖、木糖、岩藻糖和山梨糖组成, 根据峰面积计算摩尔比为4.91 : 3.14 : 4.35 : 1.00; PaPS由鼠李糖、木糖、甘露糖、岩藻糖、半乳糖和山梨糖组成, 摩尔比为1.00 : 3.39 : 1.10 : 3.78 : 1.12 : 5.60; SaPS由鼠李糖、木糖、甘露糖、岩藻糖和半乳糖组成, 摩尔比为5.82 : 10.80 : 3.10 : 11.26 : 1.00; BePS由木糖、岩藻糖和半乳糖组成, 摩尔比为1.00 : 1.69 : 1.18; CaPS由鼠李糖、木糖、甘露糖、岩藻糖和半乳糖组成, 摩尔比为1.00 : 3.18 : 1.70 : 7.65 : 1.13。
Fig. 3 GC chromatogram of five crude algal polysaccharide

图3 5种海藻粗多糖的气相色谱图分析
2. L-鼠李糖(L-Rha); 4. D-木糖(D-Xyl); 5. D-甘露糖(D-Man); 6. L-岩藻糖(L-Fuc); 7. D-半乳糖(D-Gal); 8. L-山梨糖(L-Sor)

2.3 红外光谱分析

图4为5种海藻粗多糖红外光谱图, 可知5种海藻粗多糖具有数个相同的糖类化合物的特征吸收峰(李伟欣 等, 2008; 柳红 等, 2008): 在3700~3200cm-1范围内出现宽峰, 说明几种粗多糖分子都存在分子间和分子内O-H键的伸缩振动; 在3000~2800cm-1区域内的吸收峰是多糖分子C-H伸缩震动引起的, 而在1420cm-1处出现的吸收峰说明几种多糖分子存在羧基的C=O键(孟庆勇 等, 2006)。5种海藻粗多糖(PaPS、SaPS、CaPS、UlPS和BePS)分别在1622.32、1635.82、1634.86、1635.82和1652.21cm-1处有酰胺的C=O伸缩振动引起的吸收峰(孟庆勇 等, 2006; 梅光明 等, 2014)。此外, CaPS、SaPS和BePS分别在1236.63、1259.77和1259.77cm-1处存在较为明显的吸收峰, 这主要是由硫酸基团中S=O的对称伸缩振动引起的(张颖 等, 2006; 廖滢 等, 2015)。
PaPS在1124.78cm-1处存在一个明显的吡喃环C-O键, 但并未检测到其他呋喃或吡喃糖特征峰。UlPS在1144.55和1093.92cm-1处是吡喃环C-O的两个吸收峰, 而851.42cm-1处形成的吸收峰表明组成该糖的单糖为α-吡喃糖(盛家荣 等, 1999)。BePS在1158.53和1072.71cm-1处是吡喃环C-O的两个吸收峰, 在931.45cm-1是呋喃环的吸收峰, 由呋喃环对称伸缩振动造成, 而在892.40和846.60cm-1处分别是吡喃糖β型和α型C-H变角振动的吸收峰, 表明该多糖存在呋喃糖和吡喃糖, 并且吡喃糖苷键存在β和α型(Shang et al, 2013)。CaPS在1200~1000cm-1处存在较为明显的3个特征峰(1153.22、1078.53和1027.39cm-1), 推测CaPS含有吡喃糖的C-O-C特征骨架(邢晓旭 等, 2013)。此外, 808.51cm-1处的特征峰则说明CaPS多糖分子中存在甘露糖苷键(夏朝红, 2007)。SaPS在1081.87和1034.14cm-1处存在两个较不明显的吸收峰, 推测该多糖可能含有吡喃糖, 而819.12cm-1处的特征吸收峰进一步确定该多糖含有α-D-半乳吡喃糖(宋云端 等, 2007)。
Fig. 4 Infrared spectra of five crude algal polysaccharide

图4 5种海藻粗多糖红外光谱图

2.4 多糖分子量的测定

根据葡聚糖的标准曲线, 由GPC专用软件计算5种海藻粗多糖的重均相对分子质量Mw、数均相对分子质量Mn及分布系数D(表1)。PaPS的分子量最高, Mw为119.1kD; UlPS次之, Mw为19.6kD; BePS和CaPS的Mw较为接近, 分别为8.3和8.6kD; 而SaPS的Mw最小, 仅为3.7kD。从分布系数D来看, UlPS的分布系数为2.086, 分子量分布最宽, 多糖均一性最差, SaPS、BePS和CaPS的分布系数大于1, 分子量分布相对较宽, 均一性表现较差, PaPS的分布系数接近1, 说明该多糖分子量分布较窄, 均一性最好。
Tab. 1 Weight average molecular mass, number average molecular mass, and distribution coefficient of five crude algal polysaccharide

表1 5种海藻粗多糖的重均分子量、数均相对分子质量及其分布系数

Mw Mn D(Mw/Mn)
UlPS 19570 9382 2.086
SaPS 3736 2611 1.431
PaPS 119100 113700 1.048
BePS 8337 5130 1.625
CaPS 8645 7048 1.227

2.5 多糖硫酸基团含量测定

硫酸基团是酸性活性多糖的重要特征之一, 并且多糖活性与分子中硫酸基团的含量有着直接关系(石清东 等, 1993)。通过对5种粗多糖的硫酸基团含量进行测定, 发现不同海藻粗多糖的硫酸基团含量存在较为明显的差异。PaPS的硫酸基团含量为38.43%(±2.38%), 明显高于其他几种海藻多糖; UlPS、SaPS和BePS的硫酸基团含量较为接近, 达到30%左右; 而CaPS的硫酸基团含量最低, 仅为8.92%(±1.04%)(图5)。
Fig. 5 Contents of sulfate groups in five crude algal polysaccharide

图5 5种海藻粗多糖的硫酸基团含量

3 讨论

生物多糖参与分子间和细胞间的相互识别、信号转导等多种生理过程。越来越多的研究表明生物多糖的结构、空间构象、分子量大小、化学修饰等与其生理功能有密切关系(陈洪亮 等, 2002)。海藻中含有丰富的多糖, 除具有传统的工业价值外, 也具有广泛的生物学活性, 如抗感染、抗肿瘤、抗凝血、抗辐射以及调节免疫功能等(Schaeffer et al, 2000; Pereira et al, 2002; 李德远 等, 2002; Koyanagi et al, 2003; 张赛金 等, 2003; 王静凤 等, 2003; Chew et al, 2008; Vijayabaskar et al, 2012)。
紫外光谱分析表明, 5种海藻粗多糖在190~ 200nm有糖类化合物的强吸收峰, 280nm处均无蛋白吸收峰, 说明5种粗多糖蛋白含量极低, 但UlPS、CaPS、PaPS和SaPS等4种多糖在260nm处有核酸吸收峰, 提示这4种多糖可能包含胞质多糖, 而BePS无核酸吸收峰, 说明该多糖主要来自胞外。气相色谱分析结果指出, 5种海藻粗多糖均含有木糖和岩藻糖; 除UlPS外, 其他4种海藻多糖均检测到半乳糖, 但其在PaPS、SaPS和CaPS中的相对含量较低。值得注意的是, 山梨糖是一种具有还原性的酮糖, 可作为合成维生素C的前体原料。本研究在褐藻门的PaPS和绿藻门的UlPS中均检测到山梨糖, 并且PaPS的山梨糖含量较为丰富, 而其他3种多糖中未检测到, 这在此前的研究中较为少见。有研究表明褐藻门马尾藻属的羊栖菜多糖含有一定量的山梨糖(岑颖洲 等, 2004; 陈帆 等, 2004), 提示山梨糖可能存在于褐藻门海藻多糖中, 在检测褐藻门海藻多糖组分时需要考虑增加山梨糖这一标准品。分子量分析指出, PaPS属于大分子量均一性多糖, SaPS为较小分子量的非均一性多糖, 而UlPS的均一性最差, 分子量分布相对较宽。红外光谱分析显示了五种海藻粗多糖具有明显的糖类化合物特征峰, 其中1650cm-1和1420cm-1附近的C = O吸收峰表明五种海藻粗多糖均属于酸性多糖(孟庆勇 等, 2006)。CaPS、SaPS和BePS存在明显的S=O对称伸缩振动引起的吸收峰(张颖 等, 2006; 廖滢 等, 2015), 说明这3种多糖均含硫酸酯; 而PaPS和UlPS并未检测到硫酸基团的特征吸收峰, 但明胶—氯化钡实验指出PaPS和UlPS的硫酸基团含量分别为38.43%(±2.38%)和31.77%(±2.88%), 这一结果与红外光谱分析结果较不一致, 其原因可能是粗多糖中的其他成分遮盖了红外光谱中硫酸基团的吸收峰, 这需要通过实验进一步证实。
由于多糖的结构比蛋白质和核酸的结构更为复杂, 其单糖组成、官能基团及糖基连接方式很难用一种或几种方法分析及确定, 在多糖结构分析过程中, 需要结合红外光谱、核磁共振、质谱等多种方法进行全面的结构解析。本研究中, 单糖组成使用了GC法检测糖腈衍生物, 虽然检测到几种海藻多糖的单糖组成, 但只针对能够糖腈化的单糖, 对于非糖腈化的单糖, 还需要使用液相色谱及质谱做进一步分析, 这导致本研究具有一定的局限性; FTIR法检测到几种多糖的特征峰, 并确定为酸性多糖, 但相关基团(如硫酸基团)仍需要使用离子色谱法做进一步确定, 尤其是α和β型糖苷键类型, 需要结合核磁共振做进一步分析, 这也是本研究的不足之处。综上所述, 本研究初步分析了南海海域隶属不同属种的5种海藻多糖的单糖组成、官能团及分子量, 分析结果有助于阐明上述海藻多糖的化学结构, 并为进一步研究多糖的生物活性和构效关系提供了一定的理论依据及参考。

The authors have declared that no competing interests exist.

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