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2018 , Vol. 37 >Issue 6: 120 - 132

DOI: https://doi.org/10.11978/2017130

Marine Biology

Grazing of three common protozoan on brown tide alga Aureococcus anophagefferens

  • CHEN Yao ,
  • YANG Xilu ,
  • HE Xuejia
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  • Key Laboratory of Eutrophication and Red Tide Prevention of Guangdong Higher Education Institutes, Research Center of Harmful Algae and Marine Biology, Jinan University, Guangzhou 510632, China
Corresponding author: HE Xuejia. E-mail:

Received date: 2017-12-13

  Online published: 2019-05-06

Supported by

Natural Science Foundation of Guangdong Province (2017A030313217);Fundamental Research Funds for the Central Universities (21617450);National Marine Public Welfare Industry Research Project (201305003)

Copyright

热带海洋学报编辑部
Fold

Abstract

With the increase of marine plastic waste, marine microplastics have attracted more and more attention as a new type of marine pollution. At present, studies of the source, distribution and analytical approach of microplastics are well recognized. Most research focuses on plastic ingestion by marine organisms, and on the effects of microplastics adsorbing and releasing toxic chemicals. However, the role of microplastics as a vector for pelagic microorganism, phytoplankton and micozooplankton is poorly understood. In this review, we address three functions of microplastics as a biological vector. 1) Aggregation, it is easy for biofilms to form a microbial community on the surface of microplastics, which provide the means for horizontal transfer of organisms and genes, and may lead to the transformation or transduction of pathogenic gene, antibiotic resistance gene (ARGs), called genetic exchange. 2) Dispersal, the spread of harmful algal species, pathogenic bacteria and drug-resistant bacteria as well as other microorganisms may happen when the microplastics are freshly from the waste water flow, which potentially poses a risk of invasion when arriving in a new habitat with favorable condition. 3) A feeding enhancement concept, we propose this concept because a piece of microplastics is full of the attached biofilms, nutrients and organisms, which may attract large grazers or predators and can also improve their predation efficiency. As a result, these grazers/predators may seek pieces of microplastic as foods, which may cause more serious toxicological effects. The review focuses on the ecological effects of “microplastic + biology”.

Key words： brown tide; A. anophagefferens; protozoan; grazing; EPS

Cite this article

CHEN Yao , YANG Xilu , HE Xuejia . Grazing of three common protozoan on brown tide alga Aureococcus anophagefferens[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2018 , 37(6) : 120 -132 . DOI: 10.11978/2017130

抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)是引发褐潮的主要原因种之一, 其引发的褐潮在美国和南非等地持续了20年之久(Bricelj et al, 1997; Probyn et al, 2001; Deonarine et al, 2006)。近些年, 褐潮在我国东部沿海地区也频繁爆发, 不仅严重破坏了当地海洋生态系统, 而且给旅游业、渔业以及水产养殖业带来巨大损失(公晗 等, 2014; 宋广军 等, 2014; 乔玲 等, 2016; 雷蕾 等, 2016; 宋伦 等, 2017)。
由于原生动物类群具有宽泛的摄食谱, 因此其摄食行为成为决定浮游植物藻华爆发生消的重要生物因子(Smayda, 2008)。微型浮游生物对抑食金球藻的摄食压力及其对褐潮的潜在控制也受到广泛关注。以往的相关工作以现场研究为主。Sieburth等(1989)的现场调查发现, 吞噬性原生动物在褐潮高峰期时密度降低, 但在衰亡期可明显观察到其对抑食金球藻的摄食。在Mehran(1996)的研究中, 高密度抑食金球藻褐潮水体中, 纤毛虫生长率显著减小, 并对抑食金球藻表现出避食; 室内用抑食金球藻(CCMP1708)和球等鞭金藻(Isochrysis galbana)混合培养急游虫(Strombidium sp.)数日后, 发现其摄食选择性消失。显然, 在褐潮爆发的不同阶段, 原生动物类群表现出不同的生长状态和摄食倾向。近年来, 现场研究偏重于比较褐潮爆发时不同海域及不同类群生物的生长和摄食表现。Gobler等(2002)现场调查发现, 抑食金球藻褐潮爆发时, 微型浮游动物对其的摄食率明显低于对其他共存藻的摄食率。但Caron等(2004)对不同尺度的研究均表明, 微型浮游动物在褐潮爆发早期导致抑食金球藻持续死亡, 并显示吞噬性原生动物对抑食金球藻的摄食偏好具有种间差异。Deonarine等(2006)现场研究显示, 两个研究海域不同的原生动物群落结构以及抑食金球藻密度导致截然不同的摄食压力, 并进一步推测摄食压力的强弱与摄食者粒径相关。早期Caron等(1989)的研究表明, 现场以及室内培养的原生动物摄食抑食金球藻(106cells·mL-1)时, 生长率差异高达6倍, 也暗示摄食压力存在种差异性。综合这些现场研究, 可以看出, 原生动物对褐潮藻的摄食压力受到多种因素的制约, 摄食者的摄食方式、摄食者与藻细胞粒径大小比例和藻细胞密度、生长阶段以及共存藻类等这些因素作用于原生动物摄食率和摄食选择性, 进而影响摄食压力。然而, 相关的作用机制还有待研究。
抑食金球藻能否支持原生动物类群的生长也尚无定论。早期Caron等(1989)在实验室研究中发现, 以高密度(106cells·mL-1)的抑食金球藻喂食多种微型浮游生物并未对其种群生长造成负面效应。Caron等(2004)以抑食金球藻培养分离自褐潮现场海区的海洋尖尾藻(Oxyrrhis marina)、尾丝虫(Uronema sp.)和游仆虫(Euplotes sp.), 发现原生动物生长速率与喂食优质饵料球等鞭金藻的群体并无差距, 而急游虫摄食抑食金球藻的生长率也可达0.3~0.5d-1。褐潮高峰期时, 抑食金球藻细胞密度高达1.1~1.5×106cells·mL-1, 无壳纤毛虫和丁丁虫的种群数量呈现负增长(Lonsdale et al, 1996; Mehran, 1996)。急游虫在抑食金球藻密度高达2×106cells·mL-1时仍摄食抑食金球藻, 但仅能维持较低的种群生长速率(Mehran, 1996; Caron et al, 2004)。显然, 抑食金球藻对原生动物的抑制效应具有种间差异, 并因抑食金球藻所处生长阶段的不同而不同。首先, 抑食金球藻对原生动物生长的负面效应可能与藻细胞或分泌物的毒性有关。对另一褐潮致因种Aureoumbra lagunensis的研究显示, 其胞外聚合物可抑制原生动物的摄食和生长, 因此降低了因摄食引起的藻细胞的死亡率, 这可能是促成褐潮长期持续的原因之一(Buskey et al, 1995, 1997; Liu et al, 2000a)。抑食金球藻细胞密度较高或褐潮爆发后期, 也常出现微型浮游动物对抑食金球藻的摄食率大幅降低的现象, Gobler等(2004)和Kang等(2015)推测, 抑食金球藻与A. lagunensis类似, 能释放出可抑制原生动物摄食的胞外分泌物。其次, 抑食金球藻可能无法提供摄食者生长所需的完备的营养物质。这可能造成原生动物能摄食抑食金球藻却仅维持低的生长率。捕食性原生动物可能主动避食或少食抑食金球藻, 而滤食种类虽摄食抑食金球藻但却表现出极低的生长率。然而, 抑食金球藻对原生动物生长的抑制机制的推断还缺乏直接的证据证明。
本研究选取了广泛分布于我国沿岸海域的具有不同粒径和摄食方式的三种原生动物: 海洋尖尾藻(O. marina)、海洋尾丝虫(Uronema marinum)以及扇形游仆虫(Euplotes vannus), 研究它们在单种饵料和混合饵料喂食条件下对抑食金球藻中国株指数期及稳定期细胞的摄食及生长表现, 并比较抑食金球藻这两个时期所产生的细胞胞外聚合物(extracellular polymeric substance, EPS)浓度, 旨在查清原生动物与抑食金球藻之间的互作关系。

1 材料与方法

1.1 浮游动物与藻培养

抑食金球藻中国株采自中国渤海湾附近海域, 经暨南大学赤潮与海洋生物学研究中心分离及纯化, 培养已逾2年。球等鞭金藻(I. galbana)取自中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室。三种原生动物接种自香港科技大学生命科学部微量金属生态毒理学及生物地球化学实验室。用纯水配制成的人工海水(Cavanaugh, 1956), 经高温灭菌后再配制成f/2和L1培养基, 以此分别培养抑食金球藻和球等鞭金藻。三种原生动物同样用人工海水培养, 另添加高温灭菌米粒繁殖细菌作为饵料。培养温度均为20℃, 光照周期均为L︰D=12h︰12h, 抑食金球藻及球等鞭金藻的培养光照强度分别为200和100μmol·m-2·s-1。

1.2 单种饵料生长与摄食实验

培养抑食金球藻和球等鞭金藻, 5~7d达指数生长期, 离心收集藻细胞(抑食金球藻: 5000r·min-1, 4℃, 10min; 球等鞭金藻: 2000r·min-1, 4℃, 5min), 然后用无菌人工海水重悬, 用纽鲍尔血球计数板在倒置显微镜下计数。
将处于指数生长期的三种原生动物的培养液用150μm筛绢过滤, 去除较大颗粒物。海洋尖尾藻和海洋尾丝虫滤液用7μm筛绢过滤, 而扇形游仆虫滤液用10μm筛绢过滤, 并且用新鲜无菌海水将富集后的三种原生动物仔细冲洗3~5次, 然后转移至装有无菌海水的培养皿进行饥饿处理。48h后, 取1mL培养液, 用卢戈氏碘液固定, 利用赛吉计数板于显微镜下对海洋尖尾藻和海洋尾丝虫的初始密度进行计数。将海洋尖尾藻和海洋尾丝虫分装至18支装有10mL无菌海水的15mL离心管中, 将初始浓度分别调为200和150cells·mL-1。扇形游仆虫直接用毛细管移至离心管, 初始细胞密度为10cells·mL-1。添加抑食金球藻和球等鞭金藻浓度至0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、3.0mg C·L-1(表1、2)。每个实验组包含3个平行离心管, 另设仅含藻液和仅含摄食者的空白对照。将离心管置于浮游转轮(0.8r·min-1), 于黑暗条件下孵育72h, 每隔24h取样, 样品用卢戈氏碘液固定。原生动物用1mL赛吉计数板于倒置显微镜下计数, 并测量原生动物的细胞长度和宽度, 以计算体积。藻细胞分别用0.1mL浮游植物计数框及纽鲍尔血球计数板在倒置显微镜下计数。
Tab. 1 The food concentrations for growth and feeding experiments

表1 生长和摄食实验的饵料浓度

饵料浓度
/(mg C·L-1)		 抑食金球藻细胞密度
/(×105cells·mL-1)		 球等鞭金藻细胞密度
/(×104cells·mL-1)
0.2 1.38 2.16
0.3 2.07 3.24
0.5 3.44 5.40
1.0 6.88 10.8
1.5 10.3 16.2
3.0 20.6 32.4
Tab. 2 The experimental setup of three protozoan grazing on A. anophagefferens and I. galbana in mono-algal diet or in mixed diet

表2 海洋尖尾藻、海洋尾丝虫、扇形游仆虫对抑食金球藻、球等鞭金藻的单种和混合饵料摄食实验

实验 设置 摄食者 处理 饵料浓度/(mg C·L-1)
单种饵料生长 1 海洋尖尾藻 100%抑食金球藻 0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、3.0
海洋尾丝虫
扇形游仆虫
2 海洋尖尾藻 100%球等鞭金藻 0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、3.0
海洋尾丝虫
扇形游仆虫
单种饵料摄食 3 海洋尖尾藻 100%抑食金球藻 0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、3.0
海洋尾丝虫
扇形游仆虫
4 海洋尖尾藻 100%球等鞭金藻 0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、3.0
海洋尾丝虫
扇形游仆虫
混合饵料选择性摄食 5 海洋尖尾藻 抑食金球藻(指数期)∶球等鞭金藻为
80∶20、50∶50、20∶80		 1.5
海洋尾丝虫
扇形游仆虫
6 海洋尖尾藻 抑食金球藻(稳定期)∶球等鞭金藻为
80∶20、50∶50、20∶80		 1.5
海洋尾丝虫
扇形游仆虫

1.3 混合饵料选择性摄食实验

按照收集抑食金球藻指数期细胞的方法收集生长稳定期(培养16d)细胞, 并计数。将抑食金球藻指数期和稳定期细胞分别与球等鞭金藻按照80︰20、50︰50和20︰80(碳量)的比例混合, 总的饵料浓度始终为1.5mg C·L-1(表2)。三种原生动物经48h饥饿处理后, 海洋尖尾藻和海洋尾丝虫的初始密度调至100cells·mL-1。用毛细管吸取大小相近的扇形游仆虫移至装有10mL人工海水的事先经灭菌处理的15mL离心管中, 初始细胞密度为20cells·mL-1。每个实验组包含3个平行离心管, 另设一个仅含混合藻液的空白对照。将离心管置于转速为0.8r·min-1浮游转轮上于黑暗环境中培养12h。在选择性摄食实验中, 样品处理、计数、摄食率计算的方法同1.2, 根据得到的摄食率利用Jacob’s index和Ivlev’s index两种选择性指数(Ivlev, 1961; Jacobs, 1974)判定三种原生动物在喂食按不同比例混合的饵料时的摄食选择性。

1.4 抑食金球藻培养液中胞外聚合物颗粒(EPS)的测定

固定, 计数藻细胞密度。自指数生长期(第6天)开始, 另取7mL藻液用于EPS的测定。EPS根据阿尔新蓝染料结合半定量分光光度分析法(Passow et al, 1995)测定, 根据标准曲线计算等价黄原胶量, 并将其标准化到单位细胞等价黄原胶量。Pass等(1995)介绍的半定量分析方法用于测定透明胞外聚合物颗粒(transparent exopolymeric particle, TEP)的浓度, 由于该种方法均能染上胞外壳和黏液EPS, 尽管这两种类型的EPS的组成物质存在差异, 本研究中使用该方法测定总的EPS浓度。

1.5 数据分析

1.5.1 计算公式
原生动物体积(μm3)计算公式(Menden-Deuer et al, 2000):
$\text{volume}=1/3\times \left[ \text{ }\!\!\pi\!\!\text{ }{{(\text{cell width/2})}^{2}} \right]\times (\text{cell length})$
计算三种原生动物生长率(Jeong et al, 2004), 根据Michaelis-Menten方程就生长速率与食物浓度进行拟合:
$\mu =\frac{{{\mu }_{\max }}(x-{x}')}{{{K}_{\text{GR}}}+(x-{x}')}$
其中μ代表原生动物在不同饵料浓度下的瞬时生长率(d-1); x代表饵料藻浓度(mg C·L-1); x′代表临界饵料藻浓度(mg C·L-1); μmax代表最大生长率(d-1); KGR为最大生长率一半时的饵料浓度(mg C·L-1)。
计算原生动物摄食率IR(ng C·grazer-1·d-1)(Frost, 1972; Heinbokel, 1978), 根据Michaelis-Menten方程就摄食率与食物浓度进行拟合:
$\text{IR}=\frac{{{I}_{\max }}x}{{{K}_{\text{IR}}}+x}$
x代表饵料藻浓度(mg C·L-1); Imax代表原生动物最大摄食率(ng C·grazer-1·d-1); KIR代表最大摄食率一半时的饵料浓度(mg C·L-1)。
1.5.2 统计分析
应用Origin Pro8对生长率及摄食率与饵料浓度进行拟合。应用SPSS19.0中的One-way ANOVA 和Turkey post-hoc test分析摄食者体积、生长率和摄食率随饵料浓度的变化, 不同饵料及不同摄食者之间生长率和摄食率的差异, 以及不同生长时期抑食金球藻细胞分泌EPS浓度的差异性; 应用Wilcoxon signed-rank test进行选择性指数的比较。

2 结果

2.1 原生动物的体积变化

如图1所示, 在单种饵料摄食实验中, 三种原生动物的细胞体积均随着饵料浓度的增加而增加(P<0.01, One-way ANOVA)。海洋尖尾藻和海洋尾丝虫摄食抑食金球藻时平均细胞体积显著小于摄食球等鞭金藻的细胞(P=0.004和0.009; One-way ANOVA)。扇形游仆虫则相反, 其细胞体积不受饵料种类的影响(P=0.393; One-way ANOVA)。
Fig. 1 Variation in the volumes of three protozoan grazing on A. anophagefferens or I. galbana at different food levels

图1 三种原生动物摄食不同密度的抑食金球藻(a—c)和球等鞭金藻(d—f)的细胞体积变化

2.2 生长率

三种原生动物摄食抑食金球藻或球等鞭金藻时, 生长率先随着饵料浓度增加而增加, 当饵料浓度达到1mg C·L-1后, 生长率变化趋于平稳, 变化趋势符合米氏方程(图2)。海洋尖尾藻和海洋尾丝虫摄食抑食金球藻的最大生长率(μmax)不因饵料种类而不同(P>0.05; One-way ANOVA)。扇形游仆虫摄食球等鞭金藻的μmax显然比摄食抑食金球藻时要大(P=0.02; One-way ANOVA)(表3)。
Fig. 2 Specific growth rates of three protozoan feeding on A. anophagefferens and I. galbana at different food levels

图2 三种原生动物摄食不同细胞密度抑食金球藻(a—c)和球等鞭金藻(d—f)的生长率

Tab. 3 Analysis of functional response of physiological variables, growth rate, and ingestion rate to prey concentration in three protozoa feeding on A. anophagefferens and I. galbana, respectively

表3 三种原生动物的生理参数以及生长率、摄食率对饵料浓度的响应的拟合回归分析

参数 摄食抑食金球藻 摄食球等鞭金藻
海洋尖尾藻 海洋尾丝虫 扇形游仆虫 海洋尖尾藻 海洋尾丝虫 扇形游仆虫
μmax/(d-1) 0.63±0.11 0.48±0.06 0.57±0.07 0.55±0.03 0.48±0.02 0.72±0.02
KGR/(mg C·L-1) 0.38±0.26 0.50±0.25 0.20±0.18 0.08±0.05 0.17±0.05 0.06±0.02
r2 0.91 0.96 0.83 0.93 0.98 0.92
Imax/(ng C·grazer-1·d-1) 0.64±0.15 3.04±0.74 167.64±25.01 1.76±0.50 11.83±3.49 329.33±75.92
KIR/(mg C·L-1) 0.88±0.48 4.77±1.66 1.15±0.38 1.58±0.89 4.71±2.00 2.77±1.06
r2 0.86 0.99 0.95 0.89 0.98 0.96
GGEmax 65.8%±13.0% 35.2%±6.0% 49.1%±14.6% 43.3%±11.6% 34.8%±5.4% 76.5%±2.7%
三种原生动物在摄食抑食金球藻时, μmax之间无显著差异(P>0.05; One-way ANOVA, Turkey post-hoc test), 摄食球等鞭金藻时μmax从大到小排列顺序为扇形游仆虫>海洋尖尾藻>海洋尾丝虫, 差异显著(P<0.05; One-way ANOVA, Turkey post-hoc test)(表3)。

2.3 摄食率

海洋尖尾藻、海洋尾丝虫和扇形游仆虫摄食抑食金球藻时的最大摄食率(Imax)均显著小于摄食球等鞭金藻时的Imax(P<0.05; One-way ANOVA)。三种原生动物摄食抑食金球藻的Imax存在显著差异, 按大小排序为扇形游仆虫>海洋尾丝虫>海洋尖尾藻(P<0.05; One-way ANOVA, Turkey post-hoc); 摄食球等鞭金藻时, 扇形游仆虫Imax与海洋尾丝虫间无显著差异, 但均显著大于海洋尖尾藻的Imax(P<0.05; One-way ANOVA, Turkey post-hoc)(表3)。
率持续增长, 显示出非饱和摄食, 摄食率对食物浓度的相关性分析显示其变化均符合米氏方程(P<0.05)。
Fig. 3 Ingestion rates of three protozoan feeding on A. anophagefferens and I. galbana at different food levels

图3 三种原生动物摄食不同细胞密度的抑食金球藻(a—c)和球等鞭金藻(d—f)的摄食率

海洋尖尾藻摄食抑食金球藻和球等鞭金藻时, 毛生长率(gross growth efficiency, GGE)(摄食者生物量变化/被摄食饵料的生物量变化)随饵料浓度的变化无明显规律。相应的饵料浓度条件下, 海洋尖尾藻摄食抑食金球藻的GGE均大于摄食球等鞭金藻的数值。海洋尾丝虫摄食抑食金球藻除在饵料浓度为0.2mg C·L-1时GGE出现高值以外, GGE基本上随着饵料浓度增加而增大, 而且不随饵料种类的改变而变化(P<0.05; One-way ANOVA)。扇形游仆虫也具有同样的趋势, 但摄食抑食金球藻的GGE值显著小于摄食球等鞭金藻的值(P<0.05; One-way ANOVA)(图4)。
Fig. 4 Growth gross efficiencies of three protozoa feeding on A. anophagefferens and I. galbana at different food concentrations

图4 三种原生动物分别摄食不同浓度抑食金球藻(a—c)和球等鞭金藻(d—f)时的毛生长率

2.4 选择性摄食

比较三种原生动物摄食包含抑食金球藻指数期或稳定期细胞的系列混合饵料的总摄食率, 后者显著低于前者, 并出现负值(P<0.05; One-way ANOVA) (图5)。
Fig. 5 Total ingestion rates of O. marina, U.marinum, and E. vannus on mixed diets

图5 三种原生动物摄食混合饵料的总摄食率

选择性摄食结果显示, 抑食金球藻处于指数期的条件下, 无论抑食金球藻和球等鞭金藻混合饵料是何比例(80∶20、50∶50和20∶80), 海洋尖尾藻、海洋尾丝虫以及扇形游仆虫都选择性摄食抑食金球藻(P<0.05; Wilcoxin signed-rank test)。当抑食金球藻处于稳定期时, 海洋尖尾藻只在饵料比例为50∶50时, 选择性避食抑食金球藻; 而海洋尾丝虫在三种饵料比率情况下均选择性避食抑食金球藻。扇形游仆虫在饵料比率为80:20(抑食金球藻:球等鞭金藻)时, 避食抑食金球藻, 在其他两种饵料比率下, 均不呈现明显的摄食选择性(表4)。
Tab. 4 Selectivity index for O. marina, U. marinum, and E. vannus feeding on mixtures of cells of A. anophagefferens at different growth phases and I. galbana

表4 海洋尖尾藻、海洋尾丝虫、扇形游仆虫对混合饵料中生长指数期和稳定期抑食金球藻的摄食选择性

摄食组 比例 饵料 抑食金球藻指数期 抑食金球藻稳定期
FR Ivlev's index Jacob's index 摄食行为 FR Ivlev's index Jacob's index 摄食行为
lgQ D lgQ D
海洋尖尾藻 80∶20 抑食金球藻 1.136 0.064 0.396 0.427 + 0.997 -0.003 -0.007 -0.008 0
球等鞭金藻 0.456 -0.374 -0.396 -0.427 - 1.013 0.006 0.007 0.008 0
50∶50 抑食金球藻 1.655 0.247 0.681 0.655 + 0.104 -0.812 -1.263 -0.896 -
球等鞭金藻 0.345 -0.487 -0.681 -0.655 - 1.896 0.309 1.263 0.896 +
20∶80 抑食金球藻 2.935 0.492 0.755 0.701 + 0.917 -0.044 -0.047 -0.054 0
球等鞭金藻 0.516 -0.319 -0.755 -0.701 - 1.021 0.010 0.047 0.054 0
海洋尾丝虫 80∶20 抑食金球藻 1.061 0.030 0.148 0.169 + 0.916 -0.044 -0.164 -0.187 -
球等鞭金藻 0.755 -0.140 -0.148 -0.169 - 1.336 0.144 0.164 0.187 +
50∶50 抑食金球藻 1.125 0.059 0.109 0.125 + 0.599 -0.251 -0.369 -0.401 -
球等鞭金藻 0.875 -0.066 -0.109 -0.125 - 1.401 0.167 0.369 0.401 +
20∶80 抑食金球藻 2.964 0.495 0.765 0.707 + 0.198 -0.670 -0.783 -0.717 -
球等鞭金藻 0.509 -0.325 -0.765 -0.707 - 1.201 0.091 0.783 0.717 +
扇形游仆虫 80∶20 抑食金球藻 1.125 0.059 0.351 0.384 + 0.494 -0.338 -0.786 -0.719 -
球等鞭金藻 0.501 -0.332 -0.351 -0.384 - 3.023 0.503 0.786 0.719 +
50∶50 抑食金球藻 1.201 0.092 0.177 0.201 + 0.889 -0.059 -0.097 -0.111 0
球等鞭金藻 0.799 -0.112 -0.177 -0.201 - 1.111 0.053 0.097 0.111 0
20∶80 抑食金球藻 1.575 0.223 0.265 0.296 + 0.973 -0.014 -0.015 -0.017 0
球等鞭金藻 0.856 -0.077 -0.265 -0.296 - 1.007 0.003 0.015 0.017 0

注: 摄食行为中“-”表示选择性避食, “+”表示选择性摄食, “0”表示选择性较弱。各选择性指数的范围分别为, FR: 0~1 (-), 1~∞(+); Ivlev's index: -1~0(-), 0~1(+); Jacob's index: lgQ: -∞~0(-), 0~∞(+); D: -1~0(-), 0~1(+)。

2.5 不同生长时期抑食金球藻胞外聚合物(EPS)的分泌

随着培养时间的增加, 抑食金球藻在第6天达到生长指数期, 第10天达到生长稳定期, 在第13天进入衰亡期, 藻液中EPS浓度也在不断增加。指数期EPS平均浓度为14.50±0.45 pg xanthan equiv.·cell-1, 稳定期EPS平均浓度为17.77±0.41pg xanthan equiv.·cell-1, 稳定期细胞的藻液中EPS浓度显著高于指数期(P<0.01; One way-ANOVA) (图6)。
Fig. 6 EPS concentrations of A. anophagefferens culture at exponential growth phase and stationary growth phase, respectively

图6 抑食金球藻各个生长时期细胞的EPS含量

3 讨论

3.1 单种饵料的生长和摄食

三种常见海洋原生动物海洋尖尾藻、海洋尾丝虫和扇形游仆虫在喂食抑食金球藻中国株的指数期细胞时, 其摄食率及生长率与藻细胞密度(0.2~3mg C·L-1)之间的关系均符合典型的米氏方程。原生动物的日摄食率最高可达其自身碳量的257%~1961%, 虽仅为摄食球等鞭金藻时的30%~59%, 但仍显示这三种原生动物对抑食金球藻具有较强的摄食压力。三种原生动物摄食饵料藻时的最大生长率在0.45~0.72d-1之间变化, 仅扇形游仆虫的最大生长率与饵料种类有关。
抑食金球藻褐潮频现引发学者们对褐潮中原生动物潜在摄食压力的关注。许多研究者对褐潮中微型浮游生物的摄食压力进行了现场调查和实验室研究。早期的室内实验研究了包括金滴虫(Monas sp.)、游仆虫(Euplotes sp.)、帆口虫(pleuronematid ciliate)等5种原生动物对抑食金球藻的利用, 证实了这些种类可以摄食抑食金球藻, 其中金滴虫和帆口虫的生长率可高达3.0和3.8d-1, 而游仆虫等则表现出极低的生长率(Caron et al, 1989)。该研究虽未直接测定原生动物的摄食率, 但依据生长率, 能大致推断原生动物的摄食率也存在较大差异。Caron等(2004)估算出褐潮中因微型浮游生物的摄食而导致的抑食金球藻的死亡率约为0.2~1.0d-1; 实验室以抑食金球藻培养分离自褐潮现场海区的海洋尖尾藻、尾丝虫和游仆虫, 发现原生动物生长速率与喂食球等鞭金藻的群体并无差距, 而急游虫摄食单种抑食金球藻的生长率达0.3~0.5d-1, 远低于摄食抑食金球藻和球等鞭金藻混合饵料的值。原生动物对抑食金球藻的摄食压力低于种群的生长率是褐潮得以爆发和持续的原因。Gobler等(2002)通过现场监测与室内实验发现, 在褐潮藻华期间, 微型浮游动物摄食抑食金球藻引发的死亡率仅为0.31±0.09d-1, 远低于对聚球藻及其他浮游植物物种的摄食死亡率, 因此认为原生动物对抑食金球藻的摄食压力并不能有效抑制褐潮。此外, 也有研究报道原生动物受到了抑食金球藻的抑制, 例如Mehran(1996)研究发现, 当抑食金球藻密度>105cells·mL-1时, 纤毛虫的生长率大大减小; Lonsdale等(1996)也报道了在褐潮藻密度达到高峰值时丁丁虫和砂壳纤毛虫呈现负生长的情况。上述研究显示, 相当多的原生动物种类都可摄食抑食金球藻, 这些种类对抑食金球藻的摄食压力存在种间差异。资料显示, 海洋尖尾藻和尾丝虫都能很好地利用抑食金球藻, 但针对游仆虫得到的结论并不一致。Caron等(1989)的研究中在极高的饵料浓度条件下, 游仆虫的生长率小于0.1d-1。他们另一项研究中的游仆虫摄食抑食金球藻和球等鞭金藻时的生长率却无显著差异(Caron et al, 2004)。本研究中, 扇形游仆虫的生长率为0.3~0.72d-1, 摄食球等鞭金藻时较高, 我们推测这是由于不同研究选取了不同的物种。同属物种尚且有如此大的差别, 亲缘关系远的物种之间的差异也就不足为奇。本研究还显示, 三种原生动物Imax从大到小的排列顺序刚好与三种原生动物的粒径大小排序相符; 当饵料浓度达到3mg C·L-1时, 海洋尖尾藻的摄食率已达饱和, 而其他两种原生动物的摄食率仍呈上升趋势, 这似乎暗示原生动物摄食抑食金球藻的摄食率有随动物粒径增大的趋势。类似地, Hansen等(1997)对资料中2~2000μm粒径范围内多种浮游动物的生长率和摄食率进行分析和比较后发现, 纤毛虫的摄食率平均超出了鞭毛虫摄食率的2~4倍。
三种原生动物对抑食金球藻能否有效利用还可通过GGE体现。海洋尖尾藻和海洋尾丝虫摄食抑食金球藻时的GGE高于或等于摄食球等鞭金藻时的值, 表明对于这两种原生动物而言, 抑食金球藻的品质不亚于作为优质饵料的球等鞭金藻。Bricelj等(1989)的研究也证实了抑食金球藻藻细胞的营养组成(必需多不饱和脂肪酸, essential polyunsaturated fatty acids, PUFA)与优质藻饵料相当。而就扇形游仆虫来说, 摄食率、生长率及GGE都说明球等鞭金藻是比抑食金球藻更优质的饵料。当体系中仅存在单一可利用营养(例如不同的单种饵料资源)时, 浮游动物由于感知、摄取饵料能力、处理和同化摄入食物的差异性, 会呈现出不同的功能响应(Fenchel, 1980; Jonsson, 1986; Jonsson et al, 1990; Demott et al, 1991)。Caron等(2004)基于体系生物体积变化计算出海洋尖尾藻、尾丝虫和游仆虫的GGE分别为32%、48%和47%, 两种纤毛虫原生动物的GGE与本研究的结果较为接近, 但海洋尖尾藻的GGE较本研究低。他们所用的饵料浓度为5.5×106cells·mL-1, 为本研究饵料浓度的2.8倍, 这可能是造成差异的原因之一。而且, 本研究所列结果为计算出的预测最大GGE值, 这亦可能造成差异。本研究中的海洋尖尾藻摄食抑食金球藻指数期细胞的摄食率虽不及另两种原生动物, 但因转化效率最高, 能有效地将褐潮藻的能量物质输送到更高的营养级。据报道, 微型鞭毛虫(<20μm)是褐潮藻抑食金球藻的主要消费者, 并且在浮游动物生物群落中占据主导地位(Lonsdale et al, 1996; Mehran, 1996; Gobler et al, 2004)。倘若海洋尖尾藻能代表大多数的微型鞭毛虫, 那么至少在褐潮爆发的初期至高峰期前, 微型鞭毛虫对抑食金球藻的摄食在海域生态系统物质能量的传递中扮演着重要角色。

3.2 混合饵料选择性摄食

三种原生动物摄食抑食金球藻中国株的指数期藻细胞和球等鞭金藻的混合饵料时, 两类选择性指数—Jacob’s 指数和Ivlev’s 指数显示三种原生动物均倾向于摄食抑食金球藻, 与饵料中抑食金球藻和球等鞭金藻的比例无关。研究原生动物对抑食金球藻的选择性摄食的资料并不多。Mehran(1996)研究了急游虫(Strombidium sp.)摄食球等鞭金藻和抑食金球藻混合饵料的摄食表现, 发现喂食初期, 急游虫对抑食金球藻(CCMP1708)虽有摄食, 但仍倾向于摄食球等鞭金藻, 不过, 随着对饵料环境的适应, 摄食选择性消失, 显示了急游虫摄食的可塑性。原生动物的选择性摄食是其与饵料颗粒互作综合的结果, 因此受到多种因素的制约。饵料颗粒的粒径是决定选择性摄食的关键因子, 本研究的三种受试动物中, 海洋尖尾藻的饵料谱最广, 可摄食粒径为2~30μm的饵料(Dodge et al, 1971, 1974; Flynn et al, 1996; Hansen et al, 1996; Jeong et al, 2008; Roberts et al, 2011)。但一些研究表明, 海洋尖尾藻摄食粒径≥4μm的鞭毛藻时可获得较高生长率(Hansen et al, 1996; Jeong et al, 2001, 2003)。本研究的单种饵料摄食实验中计算出的毛生长率暗示抑食金球藻对于海洋尖尾藻而言是营养更为充足的饵料, 这或许是海洋尖尾藻在混合饵料中对抑食金球藻有更高摄食率的原因。海洋尾丝虫和扇形游仆虫作为典型的食细菌动物(Turley et al, 1986; Bernard et al, 1990; Tuorto et al, 2014), 当摄食不同大小粒径的混合饵料时, 可能更偏向于选择粒径较小的饵料颗粒。这似乎与单种饵料摄食实验中观测到的原生动物对球等鞭金藻具有较大摄食率的结果不符, 但或许正如 Gentleman等(2003)指出的, 浮游动物在混合饵料喂食的情况下会采取主动转换摄食的方式, 这种方式无法由单种饵料条件下摄食的方式来推知, 但却可能是最优化的营养获取途径。
在摄食含有抑食金球藻中国株稳定期后期细胞的混合饵料时, 海洋尖尾藻和扇形游仆虫避食抑食金球藻或不表现摄食选择性, 海洋尾丝虫则始终避食抑食金球藻, 这与前述的摄食抑食金球藻指数生长期细胞和球等鞭金藻混合饵料的结果截然不同。此时, 三种原生动物总的摄食率也显著减小(图6), 似乎表明抑食金球藻稳定期细胞还影响了原生动物对球等鞭金藻的摄食。以往的现场研究显示, 抑食金球藻密度较高或藻华爆发后期, 微型浮游动物对抑食金球藻的摄食率会大幅度降低(Lonsdale et al, 1996; Gobler et al, 2002)。 Deonarine等(2006)在褐潮频现区域的研究显示, 在褐潮爆发期间(藻密度>106cells·mL-1), 摄食者选择性避食抑食金球藻; 在非褐潮密度条件下, 摄食者则主动摄食抑食金球藻。选择性摄食实验和这些现场调查的综合结果暗示, 抑食金球藻细胞在不同生长阶段的某些特质决定了原生动物对抑食金球藻的选择倾向。对不同生长时期抑食金球藻的胞外聚合物颗粒(EPS)浓度的半定量测定显示, 稳定期抑食金球藻细胞产生的EPS显著高于指数期细胞, 在抑食金球藻培养液达到衰亡期时, EPS成倍增长。另一褐潮藻A. lagunensis分泌的EPS可抑制海洋尖尾藻、游仆虫和楯纤虫(Aspidisca sp.)等原生动物对其的摄食, 而纤毛虫在摄食含低EPS饵料时的生长率显著高于含高EPS的饵料(Buskey et al, 1995, 1997; Liu et al, 2000b)。Gobler等(2004)和Kang等(2015)也认为, 褐潮中摄食者的避食性可能源于抑食金球藻释放出可抑制原生动物摄食的某种物质。本研究中单种饵料摄食实验排除了抑食金球藻是原生动物的劣质饵料的可能性, 但是在不同饵料条件下, 摄食者摄食表现存在的较大差异可能正如许多研究指出的那样, 藻细胞的表面特征、化学信息物质以及二甲基巯基丙酸(dimethylsulphoniopropionate, DMSP)裂合酶活性等都对摄食者的摄食行为产生重要影响(Brussaard et al, 2001; Evans et al, 2006, 2007, 2008)。胞外聚合物的分泌增加了海水的黏性, Malej等(1993)认为海水黏度的增加会阻断摄食者与饵料之间的会遇率并增大摄食耗能。此外, Passow等(1999)提出, 浮游动物可利用EPS 中的TEP成分, 由此减少了对藻的摄食, 但仅是表观上摄食率的减少。我们推测, 对吞噬摄食的海洋尖尾藻而言, 黏液层可能阻碍了介导饵料和摄食者之间相联系的信号分子传递, 导致摄食者对这种新饵料不敏感。而对于滤食性纤毛虫, EPS会黏附用于捕食的纤毛, 或者阻塞滤器, 从而导致对抑食金球藻的摄食大大降低。另一方面, EPS也使饵料黏附成粒径相当的细胞团, 扇形游仆虫对抑食金球藻和球等鞭金藻的差异摄食可能因此减弱。然而, 抑食金球藻对原生动物的作用机制可能与EPS以外的物质有关。DMSP这类物质就可能作为一种化学信号影响饵料与摄食者之间的互作。有研究证实海洋尖尾藻能对饵料释放出的包括某些氨基酸和DMSP等化学信号分子作出积极的运动方面的响应(Martel, 2006; Deuer et al, 2006; Breckels et al, 2011)。然而, Keller等(1989)发现抑食金球藻单位体积内含有较高水平的DMSP, 但是摄食过程中DMSP裂解产生的甲基或丙烯酸, 或衰老的含DMSP的藻细胞并未对滤食摄食者产生毒性作用。总之, 抑食金球藻抑制原生动物摄食的机制还需深入研究查证。
本研究涉及的三种常见原生动物, 在褐潮爆发初期或非藻华时期对抑食金球藻的旺发具有不同程度的潜在抑制作用。海洋尖尾藻对抑食金球藻的摄食压力最大, 可能控制了褐潮的爆发。如果原生动物的摄食压力可与抑食金球藻的种群增长抗衡, 就可避免褐潮的继续发展。然而, 爆发高潮期或衰退期的情况则相反, 由于EPS的大量存在, 尾丝虫由于避食抑食金球藻可能助长褐潮的持续存在, 而另两种原生动物对其的摄食压力已经减弱, 也无法促成抑食金球藻的快速消亡。三种原生动物对抑食金球藻的摄食潜力与其粒径相关, 但摄食率和摄食选择性很难以摄食类型来区分, 因此, 需要在原生动物的粒径谱和摄食类型等方面做出更多的比较研究, 才有助于在褐潮中估算其摄食压力。

4 结论

三种常见原生动物摄食抑食金球藻中国株指数期细胞时的摄食率及生长率随饵料浓度的变化符合米氏方程, 其摄食潜力随自身个体粒径增大而增大, 而且它们的生长效率并不因饵料种类不同而有差异。用含有抑食金球藻指数生长期细胞的混合饵料喂食的原生动物倾向于选择抑食金球藻, 当喂食含有抑食金球藻稳定期细胞的混合饵料时, 原生动物避食抑食金球藻或不表现摄食选择倾向, 这种饵料选择转变估计与稳定期细胞分泌较多的EPS有关。

The authors have declared that no competing interests exist.

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