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Journal of Tropical Oceanography >

2018 , Vol. 37 >Issue 6: 104 - 111

DOI: https://doi.org/10.11978/2018022

Marine Biology

Characterization of a ParE-ParD toxin-antitoxin TA system (SO_A0087-A0088) on a megaplasmid of Shewanella oneidensis

  • ZHAO Xuanyu , 1, 2 ,
  • SHI Fei 1 ,
  • WANG Xiaoxue , 1, 2
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  • 1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Corresponding author: WANG Xiaoxue. E-mail:

Received date: 2018-02-28

  Online published: 2018-12-24

Supported by

National Natural Science Foundation of China (31500025, 31500093)

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热带海洋学报编辑部
Fold

Abstract

Toxin-antitoxin (TA) systems are prevalent in prokaryotes. They play important roles in cell physiological activities including maintenance of mobile genetic elements and mediation of stress responses. However, studies of TA systems in the bioelectrochemically and ecologically important strain Shewanella oneidensis are limited. In this study, we characterized SO_A0087-A0088 on the megaplasmid of Shewanella oneidensis MR-1 as a typical type Ⅱ TA system that belongs to ParE-ParD family, and the overexpression of toxin A0088 leads to filamentous growth. We found that the antitoxin SO_A0087 could bind to promoter of SO_A0087-A0088 in vitro, and three amino acid residues of toxin SO_A0088 were identified to be critical for toxicity by random mutagenesis.

Key words： toxin-antitoxin system; ParE-ParD; Shewanella oneidensis; plasmid

Cite this article

ZHAO Xuanyu , SHI Fei , WANG Xiaoxue . Characterization of a ParE-ParD toxin-antitoxin TA system (SO_A0087-A0088) on a megaplasmid of Shewanella oneidensis[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2018 , 37(6) : 104 -111 . DOI: 10.11978/2018022

希瓦氏菌(Shewanella)广泛分布于各类水体环境中, 包括淡水湖泊和海洋(Konstantinidis et al, 2009)。希瓦氏菌为异养型兼性厌氧菌, 可以利用多种电子受体进行有氧呼吸和无氧呼吸。在缺氧条件下, 它可以通过利用环境中的多种电子受体如金属离子进行呼吸作用(Wiatrowski et al, 2006; Ng et al, 2013), 比如通过细胞色素电子传递网络将电子传递至细胞外, 从而将环境中的Mn4+ 还原为Mn2+。这一特性使这类细菌在生物电化学及生物修复等领域有很好的研究前景与应用价值(Hau et al, 2007)。S. oneidensis是第一株全基因组测序的希瓦氏菌, 是研究希瓦氏菌的模式菌株(Heidelberg et al, 2002)。目前对S. oneidensis的研究主要集中在探讨生物电化学的具体分子机理及相关应用(Lovley, 2012), 而对其他方面的研究仍较少。
毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system)广泛存在于微生物基因组中, 通常由两个共转录的基因组成(Leplae et al, 2011)。其中一个基因编码不稳定的抗毒素分子(antitoxin), 另一个基因则编码稳定的毒素蛋白(toxin)。毒素-抗毒素系统最早于1983年发现于致病性大肠杆菌的低拷贝大质粒F质粒上, 研究发现它们可通过分裂后致死效应(Post Segregational Killing, PSK)维持低拷贝质粒在菌群中的稳定存在(Ogura et al, 1983)。该研究发现大肠杆菌F质粒上编码的毒素 CcdB 能够杀死丢失了F质粒的细胞,而 CcdAB毒素-抗毒素系统的存在保证了F质粒在子代的稳定存在。目前发现的毒素-抗毒素系统可分为7类, 其中Ⅱ型毒素-抗毒素系统分布最为广泛, 研究也最透彻(Syed et al, 2012)。在Ⅱ型毒素-抗毒素系统中, 抗毒素通过直接的蛋白—蛋白相互作用中和毒素的毒性。一般抗毒素或(和)合体可结合到毒素-抗毒素系统的启动子区抑制自身的转录(Chan et al, 2016)。因此, 在正常情况下, 毒素-抗毒素系统是沉默的, 而在遇到环境胁迫时, 抗毒素容易被胞内的蛋白酶水解, 释放出毒素, 使毒素发挥毒性作用。这一机制可帮助细胞应对多变的生存环境(Tsilibaris et al, 2007)。目前对S. oneidensis中毒素-抗毒素系统的研究仍较少。Wen等(2014)鉴定了MR-1基因组上的HipA-HipB II型毒素-抗毒素系统。随后, 我们课题组研究鉴定了MR-1基因组上另一对新型II型毒素-抗毒素系统 HEPN-MNT(Yao et al, 2015)及原噬菌体CP4So上的一对Ⅱ型毒素-抗毒素系统ParESO/CopASO(Yao et al, 2018)。本文鉴定了S. oneidensis的大质粒pMR-1上的一对Ⅱ型毒素-抗毒素系统SO_A0087-0088, 并发现属ParD蛋白家族的抗毒素SO_A0087, 在体外可与该毒素-抗毒素系统启动子区域相结合。并通过随机突变(random mutagenesis), 找到了影响ParE毒素蛋白SO_A0088毒性的3个关键位点。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与培养基
实验所用菌株为大肠杆菌K-12 BW25113, BL21(DE3)及S. oneidensis MR-1。大肠杆菌与S. oneidensis MR-1均使用LB培养基, 分别于37℃和30℃培养。实验中使用的羧苄西林工作浓度为100μg·mL-l, 卡那霉素工作浓度为50μg·mL-1。
1.1.2 主要试剂
实验过程中所使用的限制性内切酶购于NEB(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)公司, T4 DNA连接酶购于Takara(TAKARA, Kusatsu, Japan)公司。PCR纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于OMEGA生物技术有限公司。DNA提取试剂盒购于天根(TIANGEN, 北京, 中国)公司。PCR引物由赛默飞世尔(Invitrogen, 广州, 中国科技有限公司)合成。

1.2 分子生物学操作

使用DNA提取试剂盒提取S. oneidensis的染色体DNA, 以该DNA为模板, 以pBAD-A0087-f(5'- CTAGCCATGGGCATGAACACTCTTTCAGCCAATG-3')和pBAD-A0087-r(5'-CCCAAGCTTTTAGTCATACAGCCCTGCAGCCAG-3')为引物对SO_A0087进行PCR扩增, 以pBAD-A0088-f(5'-CTAGCCATGGGCATGGCAGTAACTTATCATTTAACA-3')和pBAD- A0088-r(5'-CCCAAGCTTTCAGATGGTTTCCCGCTCTGCGAG-3')对SO_A0088进行扩增, 以pBAD- A0087-f和pBAD-A0088-r对合体SO_A0087- SO_ A0088进行扩增。将扩增的目的片段胶回收后与提取的含受阿拉伯糖诱导的启动子的质粒pBAD经NcoI和HindIII酶切处理30min。酶切后的产物与载体再进行一次胶回收后使用T4 DNA连接酶在25℃连接反应3h。再将连接产物通过化学转化的方法, 转化至BW25113中, 并使用含羧苄西林的 LB平板筛选。重组质粒用pBAD-f(5'-ATGCCATAGCATTTTTATCCA-3')和pBAD-r(5'-TCTGATTTAATCTGTATCAGG-3')进行PCR验证, 并选取正确大小的克隆DNA测序验证。pBAD质粒在S. oneidensis中不能复制, 因此以上述构建好的重组pBAD质粒为模板, 以pBBR2-SacII-f(5'-TCCCCGCGGTGTGCCTGTCAAATGGACGAAG-3')和pBBR2-ApaI-r(5'-ACT GGGCCCCGTTCACCGACAAACAACAGAT-3')为引物进行PCR扩增, 并经SacII和ApaI酶切, 连接至能在MR-1复制的非诱导型载体pBBR1, 再转化至S. oneidensis宿主, 并使用含卡那霉素的 LB平板进行筛选, 随后用M13-F和M13-R通用引物PCR验证并测序。用于蛋白表达的重组菌株BL21(DE3)/ pET28b-A0087-CHis的构建过程与上述相同, 用于目的片段扩增的引物为pET28b-A0087-f(5'-CTAGCCATGGGCATGAACACTCTTTCAGCCAATG-3')和pET28b-A0087-r(5'-CGCGGATCCCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTCATACAGCCCTGCAGCCAG-3'), 限制性内切酶为NcoI和BamHI, 并用含卡那霉素筛选, T7及T7-ter通用引物验证。

1.3 菌落形成单位的测定

重组菌株接种于LB液体培养基培养过夜(~16h), 以初始浓度OD600=0.1转接并加入0.3%L-阿拉伯糖进行诱导表达。分别取诱导0、2、4、6和8h的菌液作梯度稀释, 并取10μL点至LB平板, 在37℃培养箱中培养过夜, 计算菌落形成单位(colony-forming units, CFU)。

1.4 重组菌株毒性的检测

将过夜培养的重组菌株的菌液用接种环分别划线于含羧苄西林和0.3%L-阿拉伯糖的LB平板, 并同时划线于不含0.3%L-阿拉伯糖, 仅含羧苄西林的LB平板作为对照, 于37℃培养箱中培养过夜, 拍照记录结果。

1.5 蛋白序列的比对分析

将收集的ParE蛋白的氨基酸序列上传到MAFFT服务器(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)进行序列比对。再将比对好的文件上传至EsPript 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)上进行展示。

1.6 易错突变

用引物对pBAD-A0087-f 和pBAD-A0087-r以pBAD-A0087重组质粒为模板进行易错PCR(error- prone PCR, epPCR)扩增(Fishman et al, 2004)。 易错PCR程序为：94℃, 5min, 1min, 94℃, 1min, 55℃, 2min, 72℃, 30个循环, 最后72℃延伸10min。将得到的PCR产物进行切胶纯化, 并用NcoI和HindIII进行双酶切并纯化, 纯化产物连接至酶切过的pBAD载体。随后将连接产物转化入DH5α感受态细胞, 于37℃复苏1h后涂布于含羧苄西林的LB平板。在平板上挑多个单克隆用pBAD-f和pBAD-r进行PCR扩增, 挑选PCR 产物条带大小正确的测序并在含羧苄西林和0.3%L-阿拉伯糖的LB平板上检测毒素蛋白的毒性。

1.7 蛋白的诱导表达与纯化

用于蛋白纯化的重组菌株在LB液体培养基中过夜振荡培养, 再用新鲜的LB培养基1%转接后培养至OD600=0.8, 然后加入0.5mmol·L-1 IPTG, 37℃振荡培养, 诱导表达4h。通过离心收集菌体, 去除上清中的培养基。在收集的菌体中加入20mL裂解缓冲液[50mmol·L-1 potassium phosphate buffer(pH 8.0), 300 mmol·L-1 NaCl和protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, USA)]重悬。使用FastPrep®-24进行机械破碎, 每次持续时间为20s, 以间隔时间为5min连续裂解5次, 所有操作保持在冰上进行。将得到的细胞裂解液低温离心取上清, 再将获得的含目的蛋白的上清与已用裂解缓冲液平衡的Ni-NTA resin(Qiagen, Hilden, Germany)混合, 在冰上低速振荡结合2h。再使用不同浓度的咪唑对结合到Ni-NTA resin上的蛋白进行梯度洗脱, 并使用Tricine-SDS-PAGE电泳检测蛋白的洗脱情况(Schägger, 2006)。选取在跑胶检测中条带大小正确的样品用Sephadex G-25 pre-packed PD-10 columns进行脱盐, 再用Bi Yuntian BCA assay kit(Haimen, China)对脱盐后的蛋白进行定量。

1.8 凝胶电泳迁移实验

将SO-A0087基因上游223bp的启动子区域以P223_A0087-f(5'-TACTTCTAAGCTTTGACCTGTGGA-3')和P223_A0087-r(5'-AAGTGAATTTTTGCTTCATTGGCT-3')为引物, 通过TA克隆的方法转接至pMD19, 得到重组质粒pMD19-P223_A0087。以M13-47和RV-M-Biotin为引物, 重组质粒为模板, PCR扩增得到被生物素标记的DNA探针。将得到的DNA探针(包含启动子区域)(4×10-3pmol)与终浓度为80ng·μL-1 的纯化的SO_A0087蛋白进行结合反应。反应体系总体为20μL, 其中含有：10mmol·L-1 HEPES(pH 7.3), 20mmol·L-1 KCl, 1mmol·L-1 MgCl2, 1mmol·L-1 DTT和5%甘油。反应条件为：25℃, 2h。 使用6%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳, 电压设为400mA, 时长为30min。再将结合的蛋白转移到尼龙膜上。采用紫外灯交联5min, 采用LightShift® Chemiluminescent DNA EMSA试剂盒(Thermo Scientific, Hudson, NH, USA)检测生物素标记的DNA。

2 结果

2.1 S. oneidensis内源性大质粒pMR-1上存在潜在的ParE-ParD毒素-抗毒素系统

ParE-ParD毒素-抗毒素系统广泛分布在质粒上, 并且在质粒的稳定性方面发挥重要作用。目前, 在S. oneidensis的大质粒pMR-1上预测出6对Ⅱ型毒素-抗毒素系统(图1a)(Yao et al, 2018)。其中的ParE-ParD毒素-抗毒素系统由在同一个操纵子的两个基因编号为SO_A0087及SO_A0088的小基因组成。SO_A0088由390个碱基对组成, 其上游的抗毒素由260个碱基对组成(图1b)。SO_A0087被预测为抗毒素, 它含有具DNA结合功能的Phd/YeFM结构域, 其下游的SO_A0088与SO_A0087有一个碱基对的重叠, 属ParE毒素家族。因此, 我们推测ParDE毒素-抗毒素系统为一对典型的Ⅱ型毒素-抗毒素系统。
Fig. 1 Putative type II TA systems on megaplasmid of S. oneidensis MR-1 and characteristics of ParDE TA system. (a) Distribution of six putative type II TA systems on megaplasmid of S. oneidensis MR-1.
The ParDE TA system is marked in red rectangle. (b) Genomic organization of putative ParDE (SO_A0087-A00887) TA system. The start and stop codons are highlighted in bold.

图1 Ⅱ型毒素-抗毒素系统在S. oneidensis的质粒上的分布(a)及ParDE毒素-抗毒素系统的特征(b)
b为ParDE毒素-抗毒素系统基因分布示意图及核苷酸序列, 加粗部分分别代表起始密码子与终止密码子

2.2 ParE-ParD毒素-抗毒素系统的鉴定

将抗毒素parD (SO_A0087)、毒素parE(SO_ A0088)以及parD-parE(SO_A0087 SO_A0088)基因的编码区分别克隆至pBBR2质粒, 再转化至原宿主MR-1, 在LB培养基中加入50μg·mL-1卡那霉素和0.3%L-阿拉伯糖, 诱导表达并测定其生长曲线(图2a), 同时将诱导6h的菌液进行稀释点板(图2b)及镜检(图2d)。结果显示在原宿主MR-1中单独诱导表达毒素SO_A0088时会对细胞造成毒性, 而单独诱导表达抗毒素SO_A0087及诱导表达合体SO_A0087- SO_A0088时均不会对细胞造成毒性。且过度表达毒素SO_A0088时, 在显微镜下可观察到细胞明显变长, 细胞分裂存在缺陷。将处于稳定生长期的这些MR-1克隆菌株分别划线于添加或不添加含50μg·mL-1卡那霉素和0.3%L-阿拉伯糖的LB平板上, 过夜培养, 发现只有单独诱导毒素SO_A0088表达时才会对细胞造成毒性(图2c)。将抗毒素基因SO_A0087、毒素基因SO_A0088以及合体SO_A0087 -SO_A0088分别克隆至pBAD质粒, 再转化至大肠杆菌BW25113, 进行异源表达也得到了一样的结果(图3)。但单独诱导毒素SO_A0088表达时其对大肠杆菌BW25113的毒性作用较MR-1弱(图3c)。因此, SO_A0087 和SO_A0088组成一对毒素-抗毒素系统。
Fig. 2 Identification of SO_A0087-0088 as a TA system in S.oneidensis MR-1.
(a) The CFU of exponentially growing MR-1 was measured over time after the expression of pBBR2-based constructs that were induced with 0.3% L-arabinose at OD600 0.1. Data points represent average and standard deviation of three independent experiments. (b) CFU of pBBR2-based constructs after 6-h induction with 10 mM L-arabinose. (c) Growth of MR-1 harboring pBBR2-based constructs on LB plates containing 50μg/ml kanamycin with or without 0.3% L-arabinose. Plates were incubated for 16 h. (d) Morphology of pBBR2-based constructs under contrast microscope. Cells for observing were grown in LB and induced with 0.3% L-arabinose for 2 h

图2 在S.oneidensis MR-1中鉴定SO_A0087-A0088毒素-抗毒素系统
a. 在原宿主S.oneidensis MR-1中分别过表达SO_A0087, SO_A0088及SO_A0087-0088, 使用L-阿拉伯糖诱导, 诱导时菌液的起始浓度为OD600 0.1, 并在诱导后的0、2、4、6、8h取样稀释点至LB平板, 再经过夜培养后计算菌落形成单位; b. 展示诱导6h时各重组菌株的菌落形成单位; c. 在添加或不添加L-阿拉伯糖的含50μg·mL-1卡那霉素的LB平板上检测重组菌株的毒性; d. 诱导6h时各重组菌株的细胞形态

Fig. 3 Identification of SO_A0087_0088 as a TA system in E.coli BW25113.
(a) The CFU of exponentially growing E.coli BW25113 was measured over time after the expression of pBAD-based constructs that were induced with 10 mM L-arabinose at OD600 0.1. Data points represent average and standard deviation of three independent experiments. (b) CFU of pBAD-based constructs after 4-h induction with 0.3% L-arabinose. (c) Growth of E.coli BW25113 harboring pBAD-based constructs on LB plates containing 100μg/ml carbenicillin with or without 0.3% L-arabinose. Plates were incubated for 16 h. (d) Morphology of pBAD-based constructs under contrast microscope. Cells for observing were grown in LB and induced with 0.3% L-arabinose for 6 h

图 3 在大肠杆菌BW25113中鉴定ParDE毒素-抗毒素系统
a. 在BW25113中分别过表达SO_A0087, SO_A0088及SO_A0087-0088, 使用L-阿拉伯糖诱导, 诱导时菌液的起始浓度为OD600 0.1, 并在诱导后的0、2、4、6、8h取样稀释点至LB平板, 再经过夜培养后计算菌落形成单位; b. 展示诱导4h时各重组菌株的菌落形成单位; c. 在添加或不添加L-阿拉伯糖的含50μg·mL-1卡那霉素的LB平板上检测重组菌株的毒性; d. 诱导6h时各重组菌株的细胞形态

2.3 抗毒素SO_A0087结合自身的启动子

对于典型的Ⅱ型毒素-抗毒素系统, 抗毒素蛋白或毒素-抗毒素合体可结合在该操纵子的启动子区域, 从而抑制毒素-抗毒素系统的转录, 使毒素-抗毒素系统始终维持低水平的表达(Chan et al, 2016), 抗毒素SO_A0087预计也含有DNA结合的功能结构域。因此, 我们进一步验证SO_A0087是否具有与该操纵子的启动子区域的结合能力。将抗毒素SO_A0087克隆至pET28b载体, 在BL21中表达纯化得到SO_A0087蛋白, 再通过凝胶电泳迁移实验发现, SO_A0087在体外的确能与SO_A0087-SO_A0088操纵子的启动子区域相结合(图4)。
Fig. 4 Antitoxin SO_A0087 binds to promoter of SO_A0087- SO_A0088 in vitro.
(a) Promoter region that is 223 bp upstream the start codon of SO_A0087. The predicted inverted repeat is marked with arrows. (b) Purification of antitoxin SO_A0087. (c) EMSA to detect interaction between P223 promoter DNA and antitoxin SO_A0087

图4 抗毒素SO_A0087在体外与SO_A0087- SO_A0088操纵子的启动子区域相结合
a. SO_A0087- SO_A0088上游223 bp 的启动子区域的核苷酸序列, 箭头符号标注的为预测的调控区; b. 在BL21中表达纯化抗毒素SO_A0087; c. 凝胶电泳迁移实验检测抗毒素蛋白SO_A0087与P233启动子区域的结合能力

2.4 毒素SO_A0088的同源性分析及活性位点的寻找

毒素SO_A0088所属的ParE家族分布广泛, 在各类菌株中均有分布。将SO_A0088蛋白的氨基酸序列在NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)比对, 发现SO_A0088与希瓦氏属中的其他菌株如Shewanella putrefaciens, Shewanella xiamenensis及肠道菌株如Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca基因组上的ParE相似性很高, 而与大肠杆菌的质粒RK2、霍乱弧菌及新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)基因组上的ParE相似性较低(图5a)。ParE毒素的作用靶标为DNA解旋酶, ParE毒素通过抑制其活性而影响复制及细胞的分裂(Jiang et al, 2002)。在Phyre2网站上通过序列比对, 我们选择了与SO_A0088相似度(一致性=29%)和覆盖度(90%)最高的新月柄杆菌基因组上的ParE1为模板, 进行SO_A0088的三维结构预测。预测结果的可信度为99.9%(图5c)。通过随机突变我们找到了3个影响SO_A0088毒性的位点：S13、F65和E98。这3个位点的突变使毒素SO_A0088丧失了毒性, 具体位置已标注在三维结构预测图上。E98位点由于三维结构预测图覆盖度有限而无法标注出来(图5c)。
Fig. 5 ParE proteins alignments and mutation of active sites of SO_A0088.
(a) Proteins of ParE family were aligned using MATFF server and displayed on EsPript 3.0. (b) Toxicity detection of SO_A0088 mutants in E.coli K-12 host obtained from epPCR assay on LB plates with or without 0.3% L-arabinose. (c) Predicted 3-D structure of SO_A0088. Residues obtained by epPCR assay that affected SO_A0088 toxicity are shown in white

图5 ParE家族蛋白同源性分析及活性位点的突变
a. ParE蛋白家族氨基酸序列比对; b. 在添加或不添加L-阿拉伯糖的含卡那霉素的LB平板上检测通过易错突变得到的能降低SO_A0088毒性的突变株的毒性; c. 毒素SO_A0088三维结构的预测及突变位点的位置分布, 突变位点标注为白色

3 讨论

毒素-抗毒素系统最初发现于低拷贝的大质粒上, 如F、R1和RK2, 主要功能是维持质粒的稳定性。随后在很多细菌的基因组也发现了大量的毒素-抗毒素系统。近年来测序技术发展迅速, 大量基因组测序的数据可在线获得。通过对这些数据的统计发现, 毒素-抗毒素系统在原核生物的广泛分布很可能是水平基因转移(horizontal gene transfer, HGT)导致的(Pandey et al, 2005)。我们鉴定的这对ParE-ParD毒素-抗毒素系统位于S. oneidensis中的大质粒上。将属于ParE家族的SO_A0088氨基酸序列在NCBI数据库中对比后, 我们发现该毒素不仅与一些亲缘关系较近的同属菌株的ParE序列相似度高, 且与一些肠道菌株质粒上的ParE蛋白也有很高的相似度(图5a)。这表明该对毒素-抗毒素系统可通过水平基因转移方式(如质粒的接合转移)在进化关系较远的菌株之间传播。
目前对于低拷贝大质粒上的毒素-抗毒素系统的研究仍十分有限, 且主要集中在致病菌中(Winther et al, 2011; Harms et al, 2017; Duprilot et al, 2017), 对于来自生态环境的菌株中毒素-抗毒素系统的研究相对较少, 对于这些菌株的质粒上的毒素-抗毒素系统的研究更是空白。虽然毒素-抗毒素系统最初发现的功能为维持水平基因转移元件的稳定性, 但越来越多的研究发现, 它还有更多样的生理功能, 如参与调控生物被膜的形成(Pandey et al, 2005; Wang et al, 2011)、调节细胞的代谢(McKenzie et al, 2012)以及参与细胞程序性死亡(Magnuson, 2007)等等。这些生理功能可以帮助菌株面对复杂多变的外界环境。因此, 从不同环境的菌株分离的毒素-抗毒素系统也很可能有不同的功能, 对来自自然生态环境的菌株中毒素-抗毒素系统的研究可以帮助我们寻找其新的生理功能。S. oneidensis大质粒上的多对毒素-抗毒素系统或许能帮助它应对独特生存环境带来的各种胁迫。
SO_A0088所属的ParE蛋白家族主要功能早已在大肠杆菌中得到解析(Jiang et al, 2002), 位于RK2质粒上的ParE功能为DNA解旋酶抑制剂。除RK2质粒上的ParDE外, 对质粒上的ParDE毒素-抗毒素系统的研究鲜有报道。近年来的研究也主要集中在致病菌的基因组上, 如大肠杆菌 O157:H7基因组上的paaR2-PaaA2-parE2三组分系统(Hallez et al., 2010)和霍乱弧菌基因组上的ParE2(Yuan et al., 2010)。由图5a可知, 虽然新月柄杆、大肠杆菌 O157:H7和霍乱弧菌基因组上的ParE与大肠杆菌质粒RK2上的ParE相似度低, 但它们的作用靶标均为DNA解旋酶。ParE行使其DNA解旋酶抑剂功能的特征结构与位点至今仍不清楚。这预示着, SO_A0088的作用靶标极可能也是DNA解旋酶, 但其与相应抗毒素的相互作用方式, 以及作用于靶标的具体分子作用机理可能与已报道的ParE毒素不同。有研究通过计算机模拟了ParE蛋白的3D结构, 预测它具有与RelB和YoeB毒素蛋白相似的RNA酶的结构, 推测其可能有切割RNA的酶活性(Barbosa et al, 2010)。但也有文献报道称, 虽然RelE与ParE有相似的蛋白结构, 但它们的功能产生了分化, 主要原因是ParE缺乏RelE具有的行使RNA切割功能的关键残基(Dalton et al, 2010)。
位于大肠杆菌质粒RK2上的ParE, 从C端缩短后其毒性下降(Roberts et al, 1992)。另有研究发现, 新月柄杆菌基因组上的ParE1蛋白的C端, 对ParE1蛋白的稳定性及毒性起关键作用(Fiebig et al, 2010)。我们通过随机突变找到了几个SO_A0088发挥毒性作用的关键位点, 发现其分布比较分散, 只有1个位点E98位于C端, 推测为毒性的活性位点; 另外两个位点并不在C端, 分别位于第1个α-螺旋和第3个β-折叠, 推测它们可能是因为毒素蛋白结构的破坏而影响了活性。这些关键位点的发现为后续进一步解析其功能打下了基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

References

Publishing order | Descend order by publishing year | Descend order by cited within
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