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Journal of Tropical Oceanography >

2022 , Vol. 41 >Issue 5: 105 - 116

DOI: https://doi.org/10.11978/2021155

Exploitation of Marine Resources

Oyster hydrolysates alleviate 5-fluorouracil-induced intestinal mucosal injury on S180 tumor-bearing mice*

  • YE Ziqing , 1, 2, 4 ,
  • ZHAO Xiangdan 1, 2, 4 ,
  • CAI Bingna 1, 3, 4 ,
  • WAN Peng 1, 3, 4 ,
  • CHEN Hua 1, 3, 4 ,
  • PAN Jianyu , 1, 3, 4
Expand
  • 1. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
  • 3. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Guangzhou), Guangzhou 511458, China
  • 4. Institution of South China Sea Ecology and Environmental Engineering, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
PAN Jianyu. email:

Received date: 2021-11-10

  Revised date: 2021-12-21

  Online published: 2021-12-22

Supported by

National Key Research and Development Program of China(2018YFC0311202)

Marine Economy Development Special Project of Guangdong Province(GDNRC[2020]038)

Marine Economy Development Special Project of Guangdong Province(GDNRC[2020]036)

National Natural Science Foundation of Guangdong, China(2018A030313088)

Key Special Project for Introduced Talents Team of Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Guangzhou)(GML2019ZD0406)

Key-Area Research and Development Program of Guangdong Province(2020B1111030004)

Innovation Academy of South China Sea Ecology and Environmental Engineering, Chinese Academy of Sciences(ISEE2021PY05)

Fold

Abstract

In this study, oyster meat was used as the raw material to produce trypsin hydrolysates of oyster (OYH). The amino acid composition and relative molecular weight distribution of OYH were then analyzed. The effect of OYH on reducing 5-fluorouracil (5-FU) induced intestinal mucosal injury on S180 tumor-bearing mice was preliminarily investigated. The results showed that the essential amino acids in the total amino acids of OYH accounted for 36.44 %, and content of glutamic acid was the highest. The molecular weight of OYH was mostly below 1 kDa, accounting for 92.18 %. The results showed that the tumor inhibition ratio of 5-FU group was 31.00 %. Compared with model group, the tumor inhibition ratio of mice in OYH-L+5-FU, OYH-M+5-FU and OYH-H+5-FU group were significantly increased (p < 0.001) with the percentage of 38.24 %, 46.27 % and 47.57 %, respectively. Tumor inhibition ratios of OYH-M+5-FU and OYH-H+5-FU group were greatly higher than 5-FU (p < 0.01, p < 0.001). Meanwhile, OYH can alleviate intestinal mucosal injury caused by 5-FU chemotherapy. Compared with 5-FU alone treatment, OYH-L+5-FU, OYH-M+5-FU and OYH-H+5-FU group significantly increased the villus height, crypt depth, mucosa thickness and villus surface area of small intestine (p < 0.01, p < 0.001), which indicated that OYH can improve the state of intestinal crypt and epithelial villi, maintain the integrity of the intestinal mucosal barrier during chemotherapy. In addition, compared with model group, the percentage of neutrophils was decreased but the percentage of lymphocytes was increased in OYH-L+5-FU, OYH-M+5-FU and OYH-H+5-FU group (p < 0.05, p < 0.01). And the OYH-H+5-FU group can largely increase the levels of total protein, albumin and immune globulin in serum (p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001), which showed that OYH play a role in the immunologic function, nutritional improvement and level of immune antibody regulation in serum immunoregulation. In conclusion, trypsin hydrolysates of oyster meat have the potential for becoming an adjuvant nutritional food in the process of chemotherapy, protecting intestinal mucosa and improving body tolerance.

Key words： oyster hydrolysates; chemotherapy; anti-tumor; intestinal mucosal protection; immune regulation

Cite this article

YE Ziqing , ZHAO Xiangdan , CAI Bingna , WAN Peng , CHEN Hua , PAN Jianyu . Oyster hydrolysates alleviate 5-fluorouracil-induced intestinal mucosal injury on S180 tumor-bearing mice*[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2022 , 41(5) : 105 -116 . DOI: 10.11978/2021155

*感谢中山大学生命科学学院中药与海洋药物实验室提供的帮助。
化疗是目前众多癌症治疗的主要治疗方式之一, 但化疗药物在抑制肿瘤生长的同时, 也对其他正常细胞产生细胞毒性(Gao et al, 2017; Zhang et al, 2017)。据Levit等(2021)报道, 常规化疗药物之一的5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)会抑制更新周期快的肠黏膜上皮细胞正常增殖。其次, 化疗诱导的机体免疫系统功能的低下会导致机体营养状况不良, 进而诱发强烈的不良反应。此外, 5-FU诱导由细胞因子介导的肠细胞凋亡和肠道微生物群落改变, 进一步导致肠道黏膜炎症的发生和恶化, 使患者在化疗期间出现食欲不振, 腹泻, 感染和疲倦等症状(Kato et al, 2015; Sougiannis et al, 2019; Yan et al, 2020)。有研究表明, 在接受5-FU化疗的患者当中大约有50%~80%患者伴有肠道黏膜炎症的发生(Hamouda et al, 2017; Wang et al, 2021)。尽管5-FU具有良好的抗肿瘤作用, 但严重的副作用也影响患者生活质量及化疗效果。因此, 在化疗期间针对伴随产生的肠道黏膜炎症和损伤给予适当的辅助保护治疗, 可预期获得更好的化疗效果。
我国蕴藏着丰富的海洋生物资源, 而海洋生物资源的高值化利用是海洋食品、功能食品、海洋药物的重要基础(吴园涛 等, 2012)。牡蛎是我国产量最大的养殖贝类, 富含蛋白质、维生素以及微量元素铜、锌、铁、锰和硒, 同时还含有丰富的必需氨基酸、牛磺酸、有益胆固醇以及ω-3不饱和脂肪酸等对人体健康有益的物质(Correia-da-Silva et al, 2017; Venugopal et al, 2017; Tan et al, 2020; 赵强 等, 2021)。此外, 从牡蛎提取制备的寡肽(Cheong et al, 2013; Xie et al, 2018)、糖胺聚糖(胡雪琼 等, 2009, 2014)、多糖(Cai et al, 2016, 2021)等活性物质具有免疫调节和抗肿瘤活性。近年来, 酶提取工艺的发展为牡蛎的活性成分制备及作用研究提供了高效安全的途径。由蛋白酶水解法得到的牡蛎酶解物被发现可能通过刺激机体免疫来抑制S180荷瘤小鼠的肿瘤生长(Wang et al, 2010), 以及促进脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的免疫功能(李婉 等, 2017)。我们前期研究发现, 牡蛎酶解物对肠黏膜上皮细胞IEC-6具有迁移和增殖促进作用, 但与化疗药物联用下的体内肠黏膜保护效果仍有待明确(Pan et al, 2019)。
因此, 本文将通过构建皮下移植S180细胞株的肉瘤小鼠模型, 以高、中、低3种剂量的牡蛎酶解物联合5-FU用药, 观察并测量荷瘤小鼠的肿瘤体积和重量, 测定外周血液学参数以及血清生化指标, 并进行小肠组织病理学观察, 初步探究牡蛎酶解物在减轻5-FU化疗导致的肠道黏膜损伤及相关免疫调节方面的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验动物

BALB/c小鼠购于中山大学实验动物中心东校园(实验动物生产许可证: SCXK(粤)2016-0029), 雄性, SPF级, 4~6周龄, 体重18~20g, 饲养于温度(23±1)℃, 相对湿度(50±5)%, 昼夜交替各12h的标准实验室条件下。本动物试验根据中山大学动物伦理委员会审核批准方案进行(实验动物使用许可证: SYXK(粤)2014-0020)。

1.1.2 试验材料及对照药物

牡蛎胰蛋白酶水解物(trypsin hydrolysates of oyster, OYH)粉末由本课题组制备, 是以新鲜牡蛎(Crassostrea hongkongensis)肉为原料, 通过胰蛋白酶酶解后, 再经过离心、浓缩和喷雾干燥等步骤制成的产物, 为淡黄浅绿色粉末。
氟尿嘧啶注射液购自上海旭东海普药业有限公司。

1.1.3 试剂与药物

细胞色素C、抑肽酶、杆菌肽购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司; L-氧化型谷胱甘肽购自上海生工生物有限公司; 苯丙氨酸购自美国Sigma公司; S180细胞株购自中山大学实验动物中心细胞库; 胎牛血清购自广州蕊特生物科技有限公司; 台盼蓝购自北京索莱宝科技有限公司; 杜尔贝科改良伊格尔(dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)培养基购自美国Gibco公司; 总蛋白试剂盒、白蛋白试剂盒、前白蛋白试剂盒、转铁蛋白试剂盒、免疫球蛋白M试剂盒、免疫球蛋白G试剂盒、免疫球蛋白A试剂盒、补体C3试剂盒和补体C4试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司; 石蜡购自福建启盛实验设备科技有限公司; 无水乙醇购自南京化学试剂股份有限公司; 二甲苯购自天津市百世化工有限公司; 中性树胶购自广州市秀威贸易有限公司; 甲醛购自天津市福晨化学试剂厂; AR级氯化钠购自天津市百世化工有限公司。

1.2 仪器与设备

本试验所用仪器包括1260高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司); BS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司); UV2102-PC可扫描紫外可见光分光光度计(龙尼柯(上海)仪器有限公司); FAITH-1000型全自动生化仪(南京劳拉电子有限公司); TG型高速离心机(上海安亭仪器厂); GS-15R型离心机(德国BECNIHAN); SW-CJ-2F型双人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司); DK-600型水浴锅(上海精宏实验设备有限公司); EG1150 H+C包埋机、ASP200 S真空组织脱水机、RM2245切片机、Leica DM6B全自动正置荧光显微镜(德国Leica公司); OLYMPUS CX31型显微镜(日本OLYMPUS公司); BI2000图像处理系统(成都泰盟科技有限公司); SYSMEX XN-1000[B1]血球分析仪(日本SYSMEX(希森美康)株式会社)。

1.3 试验方法

1.3.1 牡蛎胰蛋白酶水解物的制备方法

将新鲜香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)去壳取肉, 以1:4的物料比, 先加入适量蒸馏水, 匀浆至无明显颗粒的糜状匀浆液后, 再加入剩余蒸馏水, 调节pH至8.0, 搅拌均匀预热至40℃, 加入3000U·g-1的胰蛋白酶, 搅拌均匀并在pH值为8.0条件下恒温水解4h, 酶解完成后置于沸水浴中10min使酶灭活, 冷却后过滤, 过滤液经8000×g离心20min, 上清液经薄膜浓缩, 再经喷雾干燥获得该牡蛎酶解物粉末(Pan et al, 2019)。

1.3.2 牡蛎胰蛋白酶水解物的相对分子量分布分析

配制样品溶液浓度为3mg·mL-1, 采用凝胶排阻色谱进行牡蛎酶解物分子量分布的测定(巫楚君 等, 2021)。具体条件如下: 色谱柱TSK gelG2000SWXL (300mm×7.8mm), 流动相: 0.1%三氟乙酸-乙腈: 0.1%三氟乙酸-水=20:80 (v/v), 监测波长220nm, 流速0.5mL·min-1, 柱温35℃, 进样量5μL。以细胞色素C、抑肽酶、杆菌肽、L-氧化型谷胱甘肽和苯丙氨酸作为相对分子质量标准, 分子量分别为12355、6511、1422、612.63和165.2, 标准品分子量的对数(lgMw)及洗脱时间(t)的标准曲线为lgMw = -0.0154t2 + 0.2914t + 2.8323 (r²=0.9989)。

1.3.3 牡蛎胰蛋白酶水解物的氨基酸组成分析

依照《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》(中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会等, 2016)采用氨基酸分析仪进行测定, 色氨酸的测定则采用高效液相仪进行分析(巫楚君 等, 2021)。

1.3.4 动物造模、试验分组及给药

将0.2mL S180细胞株悬液注射至小鼠腹腔, 共注射5只。待小鼠腹部明显肿胀, 即为出现腹水, 说明瘤株已存活, 将小鼠颈椎脱臼处死。每只小鼠收集3~5mL腹水。吸取0.1mL腹水S180细胞悬液, 用生理盐水稀释并调整细胞浓度至2.6×107个·mL-1进行皮下注射, 按每只0.2mL接种于试验小鼠右前肢腋窝皮下(许东晖 等, 1999; 杜双双, 2018)。选取造模成功的小鼠随机分组, 每组7~10只小鼠, 分别为模型组、低、中、高剂量牡蛎酶解物联合5-氟尿嘧啶组、5-氟尿嘧啶组, 另设一组无任何处理的正常组(如表1所示)。造模成功后第2天开始给药, 连续给药15d, 牡蛎酶解物低、中、高剂量组各灌胃200mg·kg-1、400mg·kg-1、800mg·kg-1, 每天一次。其中牡蛎酶解物3个剂量组和5-FU组小鼠隔两天腹腔注射一次氟尿嘧啶溶液(30mg·kg-1), 正常对照组和模型对照组在试验期间每天灌胃等体积生理盐水。
表1 动物不同试验分组及处理方式

Tab. 1 Different experimental groups and treatments of animals

组名 是否移植肉瘤细胞株 腹腔注射5-氟尿嘧啶剂量/(mg·kg-1) 每日灌胃牡蛎酶解物剂量/(mg·kg-1)
正常组 否 — —
模型组 是 — —
5-氟尿嘧啶组(5-FU组) 是 30 —
低剂量牡蛎胰蛋白酶水解物联合5-氟尿嘧啶组(OYH-L+5-FU组) 是 30 200
中剂量牡蛎胰蛋白酶水解物联合5-氟尿嘧啶组(OYH-M+5-FU组) 是 30 400
高剂量牡蛎胰蛋白酶水解物联合5-氟尿嘧啶组(OYH-H+5-FU组) 是 30 800

注: —表示未做处理

1.3.5 体内抗肿瘤活性评价

受试期间, 每天观察小鼠外观, 包括毛色、摄食饮水、精神状态以及活动情况。同时, 每7天记录一次小鼠体质量; 每3天测量一次肿瘤的大小, 计算其肿瘤体积(武美彤 等, 2020)。肿瘤体积(单位: mm3)=长(单位: mm)×宽(单位: mm)×高(单位: mm)/2。给药结束后次日, 将小鼠颈椎脱臼处死, 剥离出肿瘤块称重记录并计算肿瘤抑制率(Zheng et al, 2021)。抑制率(单位: %)=[(模型组瘤重-给药组瘤重)/模型组瘤重]×100%。

1.3.6 小肠病理组织学观察

截取小肠组织2cm, 经中性甲醛固定, 石蜡包埋, 常规脱水后, 进行苏木精-伊红染色, 光镜下进行小肠病理学形态观察, 拍照记录小肠黏膜各层的组织学形态, 并测量小肠绒毛平均高度、绒毛平均面积、黏膜平均厚度和隐窝深度(Vieira de Barros et al, 2018)。

1.3.7 血常规指标和血液生化指标的测定

给药结束后次日, 小鼠眼眶采血0.3mL, 采用全自动血液分析仪测定小鼠血常规, 检验项目包括红细胞数目、白细胞数目、红细胞压积、血红蛋白、血小板总数、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞; 全血以3000r·min-1离心20min后, 取上层血清进行血液生化指标测定, 根据各试剂盒说明书检测血清中总蛋白、白蛋白、转铁蛋白、前白蛋白、补体(C3和C4), 免疫球蛋白 (IgM、IgA和IgG)的含量。

1.3.8 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行数据分析, 试验结果以均数±标准差($\bar{x}$±SD)表示, 两两比较采用独立样本t检验, 多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 牡蛎胰蛋白酶水解物(OYH)的相对分子量分布分析

OYH的相对分子量分布结果如图1和表2所示, 其分子质量主要集中在 1kDa 以下, 所占比例为 92.18%, 其中467Da以下的占比达83.17%。上述结果表明牡蛎肉经过胰蛋白酶水解之后产生大量的小分子肽和寡肽等小分子物质。
图1 牡蛎胰蛋白酶水解物(OYH)分子量分布图

Fig. 1 Molecular weight distribution of OYH

表2 OYH不同分子量范围所占峰面积百分比(单位: %)

Tab. 2 Percentage of peak area in different molecular weight ranges of OYH (units: %)

>5kDa 1~5kDa <1kDa
OYH 6.03 1.79 92.18

2.2 OYH的氨基酸组分分析

牡蛎肉含有丰富的蛋白质, 是制备小分子肽的主要原料之一。OYH中氨基酸组成及含量如表3所示, OYH中氨基酸含量丰富, 必需氨基酸占总氨基酸含量的36.44%, 18种氨基酸中以谷氨酸的含量最高, 天冬氨酸和甘氨酸次之。
表3 OYH的氨基酸组成分析

Tab. 3 Analysis of amino acid composition of OYH

氨基酸种类 氨基酸含量/% 氨基酸种类 氨基酸含量/%
天冬氨酸 Asp 3.76 亮氨酸 Leu* 2.39
苏氨酸 Thr* 1.65 酪氨酸 Tyr 1.60
丝氨酸 Ser 1.44 苯丙氨酸 Phe* 1.27
谷氨酸 Glu 5.80 赖氨酸 Lys* 2.58
脯氨酸 Pro 1.99 组氨酸 His* 0.88
甘氨酸 Gly 3.08 精氨酸 Arg 2.30
丙氨酸 Ala 2.46 色氨酸Trp* 0.23
缬氨酸 Val* 1.69 氨基酸总量TAA 35.29
蛋氨酸 Met* 0.60 必需氨基酸含量EAA 12.86
异亮氨酸 Ile* 1.57 EAA/TAA 36.44

注: *为必需氨基酸

2.3 OYH联合5-FU对荷瘤小鼠体重及肿瘤的影响

结果如表4所示, 各组小鼠的体重在用药过程中均呈现稳定增长的趋势。由于肿瘤的快速生长导致小鼠活动和摄食状态减弱, 进而影响体重, 与正常组相比, 各剂量联用组和5-FU组小鼠最终体质量均相对降低(p<0.01, p<0.001)。同时, 由于5-FU的化疗副作用, 与模型组相比, 经过5-FU单独用药后, 荷瘤小鼠的最终体质量相对降低(p<0.001)。但经过联合用药后, 与5-FU组相比, OYH-M+5-FU组和OYH-H+5-FU组小鼠的最终体质量相对增加(p<0.05)。
表4 OYH联合5-FU对小鼠体重、瘤重和肿瘤抑制率的影响($\overline{x}$±SD, n=10)

Tab. 4 Effects of OYH combined with 5-FU on body weight, tumor weight and tumor inhibition ratio of mice ($\overline{x}$ ± SD, n = 10)

组 别 初体重/g 终体重/g 瘤重/g 抑瘤率/%
正常组 25.99±1.23 29.11±1.50 — —
模型组 24.27±1.76 28.72±2.51 1.57±0.30 —
5-FU组 24.14±0.82 25.15±1.41***△△△ 1.09±0.16*** 31.00
OYH-L+5-FU组 24.58±1.41 25.95±1.45**△△△ 0.97±0.18*** 38.24
OYH-M+5-FU组 24.61±2.13 26.64±1.65*#△△ 0.85±0.09***### 46.27
OYH-H+5-FU组 23.94±1.92 26.84±1.83#△△ 0.82±0.19***## 47.57

注: 与模型组比较: *表示p<0.05、**表示p<0.01、***表示p<0.001; 与5-FU组比较: #表示p<0.05、##表示p<0.01、###表示p<0.001; 与正常组比较: △表示p<0.05、△△表示p<0.01、△△△表示p<0.001

通过定期测量和计算小鼠移植瘤体积发现, 小鼠肉瘤在移植后第7天开始进入快速生长期, 结果如图2a所示。在试验第13天, 与模型组相比, 经过单独用药或联合用药处理均能明显抑制小鼠肿瘤的生长(p<0.001), OYH-H+5-FU组与OYH-L+5-FU组、OYH-M+5-FU组相比具有显著差异(p<0.01); 与模型组和5-FU组相比, OYH-M+5-FU组和OYH- H+5-FU组小鼠肿瘤体积明显减小(p<0.001)。同时, OYH-M+5-FU组和OYH-H+5-FU组小鼠的肿瘤重量也显著低于5-FU组小鼠(p<0.01), OYH-L+5-FU组、OYH-M+5-FU组和OYH-H+5-FU组的抑瘤率分别为38.24%、46.27%、47.57%, 呈现剂量依赖性。
图2 OYH联合5-FU对S180荷瘤小鼠肿瘤体积大小的变化情况($\overline{x}$±SD, n=10)(a)和肿瘤解剖图(b)

图a中***表示p<0.001 (与模型组比较); #表示p<0.05、###表示p<0.001 (与5-FU组比较); $$表示p<0.01 (与OYH-L+5-FU组比较); &&表示p<0.01 (与OYH-M+5-FU组比较)

Fig. 2 Tumor volume of OYH combined with 5-FU on S180 tumor-bearing mice ($\overline{x}$ ± SD, n = 10) (a) and anatomical map of the tumor (b)

2.4 OYH联合5-FU对荷瘤小鼠小肠组织病理学的影响

不同试验组小鼠小肠的组织病理学显微观察如图3所示, 单独给予5-FU的小鼠小肠镜下可见小肠隐窝数量明显减少, 结构基本消失, 绒毛上皮细胞明显萎缩变性、坏死脱落, 进而导致腺腔扩张明显, 并且黏膜固有层和黏膜下层均有炎性细胞浸润; 同时, 如图4a~4d所示, 5-FU组小鼠的小肠绒毛高度、绒毛表面积和黏膜层宽度相对于模型组均显著减少(p<0.001), 5-FU化疗引起的肠黏膜损伤与先前的描述相一致(Zheng et al, 2019; Cai et al, 2021)。如图3d~3f所示, OYH-L+5-FU组、OYH-M+5-FU组和OYH-H+5-FU组小鼠小肠隐窝形态明显, 绒毛结构相对完整, 上皮细胞无明显坏死和脱落现象, 小肠绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度和绒毛表面积相对于5-FU组均显著增加(p<0.01, p<0.001), OYH-H+5-FU组对绒毛表面积的保护效果相对于OYH-L+5-FU组较为明显(p<0.05), 改善了5-FU造成的小肠隐窝和绒毛结构的状态, 维持肠道内环境的稳态。
图3 OYH联合5-FU对小肠组织病理学切片染色图(10×10倍)

a. 正常组; b. 模型组; c. 5-FU组; d. OYH-L+5-FU组; e. OYH-M+5-FU组; f. OYH-H+5-FU组

Fig. 3 OYH combined with 5-FU on histopathological staining of the small intestine (magnification10x). (a) Normal group; (b) Model group; (c) 5-FU group; (d) OYH-L+5-FU group; (e) OYH-M+5-FU group; (f) OYH-H+5-FU group

图4 OYH联合5-FU对小肠组织的形态学分析($\overline{x}$±SD, n=18)

a. 绒毛高度; b. 隐窝深度; c. 黏膜厚度; d. 绒毛表面积。图中**表示p<0.01、***表示p<0.001 (与模型组比较); ##表示p<0.01、###表示p<0.001 (与5-FU组比较); $表示p<0.05 (与OYH-L+5-FU组比较)

Fig. 4 OYH combined with 5-FU on histomorphological analyses of the small intestine ($\overline{x}$±SD, n = 18). (a) villus height; (b) crypt depth; (c) mucosa thickness; (d) villus surface area

2.5 OYH联合5-FU对荷瘤小鼠外周血血常规的影响

由于肿瘤迅速生长需要大量的局部供血补给, 外周血液学参数及免疫细胞的状态能够反映在治疗过程中机体的营养状态和免疫功能的差异(Cai et al, 2016)。结果如表5所示, 小鼠移植肉瘤后, 全血象发生了明显变化, 模型组小鼠的白细胞数目、血小板数目、中性粒细胞含量以及单核细胞含量均明显增加, 红细胞数目、血红蛋白含量、红细胞压积数、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞均明显减少, 说明肿瘤引起炎症反应的产生以及机体免疫功能的降低。5-FU单独处理的小鼠白细胞数目与模型组相比明显降低(p<0.001), 这与5-FU的不良反应相一致。与模型组相比, OYH-L+5-FU组、OYH-M+5-FU组和OYH-H+5-FU组的S180荷瘤小鼠白细胞数目和中性粒细胞含量均降低(p<0.05), OYH-L+5-FU组和OYH-M+5-FU组的单核细胞含量均降低(p<0.05), 但淋巴细胞含量增加(p<0.01), OYH-L+5-FU组的嗜酸性粒细胞含量增加(p<0.05), 然而与5-FU组相比均无统计学意义(p>0.05), 提示OYH联用5-FU能减轻肿瘤引起的炎症反应。与5-FU组和OYH-L+5-FU组相比, OYH-M+5-FU组小鼠的红细胞数目、血红蛋白含量和红细胞压积数均轻微降低, 与OYH-L+5-FU组相比具有显著性差异(p<0.05), 但与5-FU组无统计学意义(p>0.05), 提示联合用药对骨髓功能影响微弱。
表5 OYH联合5-FU对小鼠血常规的影响($\overline{x}$±SD, n=10)

Tab. 5 Effects of OYH combined with 5-FU on blood routine of mice ($\overline{x}$ ± SD, n = 10)

正常组 模型组 5-FU组 OYH-L+5-FU组 OYH-M+5-FU组 OYH-H+5-FU组
白细胞/(×109L-1) 6.61±2.58*** 13.22±3.23 4.71±0.99*** 4.25±1.14*** 4.12±0.46*** 4.40±0.81***
红细胞/(×1012L-1) 10.34±0.46*** 9.03±0.37 8.82±0.44 9.12±0.41 8.70±0.35$ 8.72±0.49
血红蛋白/(g·L-1) 158.90±6.79*** 136.20±6.16 134.70±5.56 138.80±5.12 133.00±5.42$ 133.10±7.46
红细胞压积/% 44.93±1.68*** 39.13±1.27 38.53±1.60 39.25±1.40 37.73±1.51*$ 37.68±1.99
血小板/(×109L-1) 1312.30±149.95*** 1740.90±169.84 1601.50±196.78 1747.00±257.28 1640.40±170.42 1817.30±209.85#
淋巴细胞/% 80.29±4.17*** 54.82±6.35 62.65±11.25 66.71±8.16** 65.15±6.27** 65.05±8.91**
中性粒细胞/% 17.47±4.08*** 39.43±6.90 32.14±9.61 28.57±7.54** 30.95±6.22** 30.22±8.20*
单核细胞/% 0.87±0.40*** 4.98±1.57 4.22±2.22 3.60±0.66* 2.99±1.00** 3.77±1.11
嗜酸性粒细胞/% 1.34±0.45** 0.74±0.19 0.99±0.51 1.10±0.46* 0.91±0.48 0.89±0.57
嗜碱性粒细胞/% 0.03±0.07 0.03±0.05 0.00±0.00 0.02±0.06 0.00±0.00 0.07±0.12

注: *表示p<0.05、**表示p<0.01、***表示p<0.001 (与模型组比较); #表示p<0.05、##表示p<0.01、###表示p<0.001 (与5-FU组比较); $表示p<0.05、$$表示p<0.01 (与OYH-L+5-FU组比较)

2.6 OYH联合5-FU对荷瘤小鼠血清生化指标的影响

外周血血清蛋白和免疫球蛋白的变化情况可以作为评估机体营养状况和免疫功能的指标之一(姚望 等, 2019)。结果如表6所示, 与正常组相比, 模型组小鼠的血清总蛋白、白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G以及免疫球蛋白M含量均显著降低(p<0.01), 补体C3和补体C4含量均显著增加(p<0.001), 说明小鼠肉瘤迅速生长导致机体消耗增加, 大量血清蛋白损耗的同时激活机体的补体系统。5-FU单独用药后, 由于免疫抑制干扰了机体正常的营养代谢和免疫功能, 导致白蛋白和补体C4水平明显减少(p<0.01)。然而, 在OYH与5-FU联合处理下, OYH-H+5-FU组的总蛋白和白蛋白含量与模型组、5-FU组以及OYH-L+5-FU组相比均明显增加(p<0.05, p<0.01, p<0.001)。同时, OYH-M+5-FU组和OYH-H+5-FU组的免疫球蛋白IgA和IgM水平均明显增加, 与模型组、5-FU组相比均具有显著性差异(p<0.05, p<0.01, p<0.001), 并且随着剂量的增加, IgM水平的增加效果越明显(p<0.05), OYH-H+5-FU组的IgG水平与5-FU组相比也显著增加(p<0.05)。OYH-L+5-FU组、OYH-M+5-FU组和OYH-H+5-FU组的补体C4水平与模型组相比降低(p<0.05), 与5-FU组相比略增加, 但无显著性差异(p>0.05)。
表6 OYH联合5-FU对小鼠血清生化的影响($\overline{x}$±SD, n=10)

Tab. 6 Effects of OYH combined with 5-FU on serum biochemical indicators of mice ($\overline{x}$±SD, n=10)

正常组 模型组 5-FU组 OYH-L+5-FU组 OYH-M+5-FU组 OYH-H+5-FU组
总蛋白/(g·L-1) 73.83±7.65*** 57.35±7.11 54.72±6.55 61.39±6.85# 64.36±8.95# 70.56±8.85**###$
白蛋白/(g·L-1) 48.41±4.62*** 36.15±5.41 29.90±3.23** 37.25±8.01# 38.36±9.21# 44.58±5.75**###$
前白蛋白/(mg·L-1) 3.74±0.70** 2.71±0.53 2.45±0.46 2.45±0.53 2.47±0.52 2.57±0.52
转铁蛋白/(g·L-1) 10.31±1.54** 8.52±1.08 8.64±1.21 9.25±1.06 9.42±1.18 9.32±1.00
补体C3 /(g·L-1) 2.56±0.61*** 3.78±0.41 3.09±1.12 3.70±0.52 3.84±0.79 3.56±0.88
补体C4 /(g·L-1) 0.38±0.07*** 0.53±0.06 0.40±0.08** 0.43±0.09* 0.43±0.07** 0.43±0.08**
免疫球蛋白A /(g·L-1) 0.37±0.12*** 0.13±0.03 0.12±0.03 0.15±0.03# 0.17±0.03*## 0.18±0.05*##
免疫球蛋白G /(g·L-1) 13.54±1.98** 10.57±2.06 10.12±0.98 10.71±2.39 11.47±2.36 11.83±1.77#
免疫球蛋白M /(g·L-1) 1.72±0.33*** 1.08±0.19 0.99±0.15 1.23±0.32# 1.56±0.26***###$ 1.64±0.25***### $$

注: *表示p<0.05、**表示p<0.01、***表示p<0.001 (与模型组比较); #表示p<0.05、##表示p<0.01、###表示p<0.001 (与5-FU组比较); $表示p<0.05、$$表示p<0.01 (与OYH-L+5-FU组比较)

3 讨论

有研究表明酶解得到的牡蛎酶解物分子量分布较宽, 包括上至10.7kDa的大分子, 下至200~500Da的寡肽(Hao et al, 2022)。在本研究中, OYH主要为低于1kDa的小分子物质, 从而具有更高的生物利用度并发挥重要的生物活性功能。
相对于蛋白质, 具有2~10个氨基酸的小分子肽不需要消化而易被小肠快速吸收(Li et al, 2019)。同时, 膳食中的氨基酸在预防和治疗肠道炎症中具有重要作用, 主要与改善肠道屏障、减轻肠道损伤, 抑制氧化应激与促炎细胞因子的表达相关(He et al, 2018)。通过氨基酸组成分析表明OYH中的氨基酸含量和必需氨基酸比例丰富。谷氨酸被认为是参与肠道蛋白质代谢, 生物活性分子合成的重要氨基酸, 是维持肠内黏膜的重要营养物质(Tomé, 2018)。天冬氨酸和甘氨酸被视为是一种具有抗炎症功能的氨基酸, 可以减轻脂多糖诱导下的肠道损伤, 改善肠屏障功能(Wang et al, 2017; Zhang et al, 2021)。在必需氨基酸中, 亮氨酸可以影响蛋白质代谢、磷酸激酶表达、细胞增殖, 并可能激活肠内雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路和细胞迁移以保护肠黏膜屏障功能(Coëffier et al, 2011)。丙氨酸作为蛋白质合成和免疫的必要成分, 可以起到肠道保护功能(He et al, 2018)。而精氨酸作为一种多功能必需氨基酸, 可以改善肠损伤后黏膜修复, 在炎症过程的调控以及肠道微生物群落的调节中发挥关键作用, 进而保护肠黏膜(Xia et al, 2016; Singh et al, 2019)。
目前, 虽然有研究表明蛋白肽类物质胰岛素样生长因子-Ⅰ (Cool et al, 2005 )和超氧化物歧化酶蛋白类似物M40403 (Yim et al, 2021)对5- FU诱导的肠黏膜炎症具有改善作用, 但其来源非天然提取所得。Li等(2019)从制备的牡蛎酶解液中分离纯化得到可以提高巨噬细胞增殖和吞噬能力以及促炎细胞因子产生的免疫调节肽。武美彤等(2020)发现牡蛎酶解物能增加荷瘤小鼠T淋巴细胞和NK细胞功能, 从而提高免疫功能。而本研究制备的低分子量牡蛎酶解物的氨基酸组成丰富, 可能具备通过调节机体免疫改善5-FU诱导的肠黏膜炎症的潜力, 目前尚无相关报道。
联合治疗可能产生潜在的附加或者协同抗肿瘤活性, 使药物发挥最佳效应(Wang et al, 2012)。本研究发现, 中、高剂量OYH联合5-FU化疗能明显提高单一化疗药物的抗肿瘤效果, 协同抑制肿瘤生长, 推测OYH可能在一定程度上促进皮下肿瘤细胞的凋亡和坏死, 从而有效抑制皮下移植肿瘤的生长(武美彤 等, 2020; Jin et al, 2021)。同时, 每天给予一定剂量的OYH与5-FU联合用药能够有效缓解小鼠在抗肿瘤过程中对机体的消耗作用, 能明显改善化疗期间因5-FU造成的腹泻、疲倦及食欲不振等严重不良反应并改善5-FU对荷瘤小鼠肠黏膜损伤导致的体重减轻和摄食量减少的状况(De Jesus et al, 2019; Zeeshan et al, 2021)。有研究表明, 抗肿瘤药5-FU会诱导激活小肠组织的半胱氨酸蛋白酶caspase8、caspase3以及相关凋亡蛋白表达, 使上皮细胞增殖减少, 其特征为隐窝凋亡增加和上皮绒毛的萎缩, 使肠黏膜组织容易受到外界细菌的感染并产生溃疡损伤, 造成肠道黏膜炎症(Sougiannis et al, 2019; Xiang et al, 2020)。结果显示, OYH联合5-FU在明显抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长的同时可以减少肠黏膜损伤, 维持上皮绒毛和隐窝的正常形态, 可作为肠内营养有效减轻化疗药物5-FU诱发的肠道黏膜炎症, 改善机体营养状况和治疗状态。
我们研究还发现, 与模型组相比, OYH联合5-FU能降低中性粒细胞含量, 提高淋巴细胞含量, 减轻肿瘤微环境引起的机体炎症反应。免疫球蛋白作为防止外来抗原侵入机体的一道防线, 对机体起到保护作用, 并参与吞噬作用, 激活补体系统(Balmant et al, 2018)。结果表明, OYH-L+5-FU组、OYH-M+5-FU组和OYH-H+5-FU组小鼠的血清总蛋白、白蛋白以及免疫球蛋白含量增加, 并且随着剂量的增加, 增加效果越明显, 其中OYH-H+5-FU组相比模型组和5-FU组显著增加, 提示高剂量OYH可能通过减少机体蛋白质损失以改善营养状况, 正向调节荷瘤小鼠的血清免疫抗体水平, 维持小鼠正常生理生化功能, 减轻化疗导致的免疫低下状态, 进而间接性提高5-FU的抗肿瘤活性。
综上所述, OYH作为肠内营养协同5-FU化疗可抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长, 并减轻化疗导致的肠道黏膜炎症, 减少肠黏膜损伤, 维持肠道屏障功能, 以及减少炎症反应和机体蛋白质损耗, 增强机体血清免疫调节功能, 改善小鼠营养状况, 维持其正常生理生化功能。然而, OYH中具体的活性物质尚未阐明, 未来仍需进一步对牡蛎酶解物进行进一步分离纯化, 并对肠黏膜保护机制进行更详细, 明确的研究。

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ZHENG JINLING, ZHANG TINGTING, FAN JIAN, et al, 2021. Protective effects of a polysaccharide from Boletus aereus on S180 tumor-bearing mice and its structural characteristics[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 188: 1-10.

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