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Journal of Tropical Oceanography >

2023 , Vol. 42 >Issue 1: 152 - 160

DOI: https://doi.org/10.11978/2022015

Exploitation of Marine Resources

Physicochemical analysis and evaluation of the antithrombotic activity of different molecular weights of heparin from clam Coelomactra antiquata

  • CHEN Guanlan , 1 ,
  • CHEN Jianping 1 ,
  • LI Rui 1 ,
  • JIA Xuejing 1 ,
  • LIU Xiaofei 1 ,
  • SONG Bingbing 1 ,
  • ZHONG Saiyi , 1, 2, 3
Expand
  • 1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety, Guangdong Province Engineering Laboratory for Marine Biological Products, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Seafood (College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University), Zhanjiang 524008, China
  • 2. Shenzhen Research Institute, Guangdong Ocean University, Shenzhen 518108, China
  • 3. Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China
ZHONG Saiyi. email:

Copy editor: YAO Yantao

Received date: 2022-01-26

  Revised date: 2022-03-29

  Online published: 2022-03-25

Supported by

Guangdong Key Area Research and Development Program Project(2020B1111030004)

National Key Research and Development Program Key Special Project(2019YFD0902005)

Shenzhen Science and Technology Program Project(PT202001-17)

Zhanjiang Science and Technology Program Project(2019A01015)

Guangdong Province High School Science and Technology Innovation Team Project(2021KCXTD021)

Shenzhen Science and Technology Program Project(JCYJ2017081818111335796)

Fold

Abstract

To investigate the physicochemical properties in vivo antithrombotic activity and their effects on the bleeding time of different molecular weights of clam heparinoid, native clam heparinoid G2 (60.25 kDa), and its two different degradation products, DG1 (24.48 kDa) and DG2 (6.75 kDa), were taken as the research objects in this study. The content of glucuronic acid and the sulfate group was respectively determined by the modified sulfuric acid-carbazole method and BaCl2-gel turbidimetric method, the particle size and zeta potential were determined by nanoparticle sizer, and the thermal stability was analyzed by the simultaneous thermal analyzer. Then the antithrombotic activity and the effect on bleeding time were investigated by the mice black tail model and mice broken tail model, respectively. The results showed that as the molecular weight of clam heparinoid decreased, the sulfate content increased, the glucuronic acid content decreased, the initial degradation temperature increased and then decreased, the particle size decreased, and the Zeta potential increased. The moderate degradation product of G2, DG1, has a higher ability to inhibit tail thrombosis with a lower risk of hemorrhage compared to the natural clam heparinoid G2.

Key words： clam heparinoid; physicochemical analysis; antithrombotic activity; bleeding time

Cite this article

CHEN Guanlan , CHEN Jianping , LI Rui , JIA Xuejing , LIU Xiaofei , SONG Bingbing , ZHONG Saiyi . Physicochemical analysis and evaluation of the antithrombotic activity of different molecular weights of heparin from clam Coelomactra antiquata[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2023 , 42(1) : 152 -160 . DOI: 10.11978/2022015

肝素(Heparin, HP)是抗血栓治疗的主要的抗凝药物, 对预防和治疗血栓性疾病有很好的效果(Di Nisio et al, 2016; Lima et al, 2017)。目前, 市面上的肝素主要来源于陆地动物, 存在资源不足、易引起病原体污染等问题, 以及出血、骨质疏松、血小板减少症等副作用(Oduah et al, 2016)。类肝素也称为“粘多糖多硫酸盐”, 指的是由肝素、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)、动植物来源的肝素样分子和硫酸化多糖等与肝素结构相似、活性作用类似的硫酸多糖(Ishihara et al, 2019)。大量研究表明, 海洋源硫酸多糖相对于陆生动物源肝素具有来源清洁、副作用少、抗血栓作用途径多等特点, 是替代商品肝素的潜力物质(Mourão, 2015)。此外, 肝素的高负电荷、大分子量和在胃肠道的不稳定性限制了其口服给药途径。口服简便, 病人依从性高, 因此高活性的肝素口服制剂急需被研发。
海蚌的学名为“西施舌”(Coelomactra antiquate), 是广温性种类的双壳类海洋贝类, 在我国山东、江苏、福建、广东、广西等沿海地区广泛分布。目前, 关于海蚌的抗血栓活性研究仍鲜有报道, 其功能活性研究主要从抗氧化(温扬敏 等, 2015)、降血脂(温扬敏 等, 2015)、降血糖(Wen et al, 2014)、抗肿瘤(温扬敏 等, 2013; 杨维群 等, 2015)、溶菌(温扬敏 等, 2010)等方向出发。此外, 《本草纲目拾遣》中记载, 海蚌为“润肺脏, 益精补阴要药”。
本课题组前期得到了一种具有良好的抗凝血活性和纤溶活性的大分子海蚌类肝素G2, 并通过降解G2获得了中分子量降解产物DG1、低分子量降解产物DG2(Du et al, 2019; 陈观兰 等, 2021)。前期研究发现, G2、DG1、DG2的基本结构及活性基团基本一致, 均具有良好的体外抗血栓活性, 但它们的高级结构不同 (陈观兰 等, 2021)。目前, G2、DG1、DG2的体内抗血栓活性还未被评价。而粒径、表面电荷、流变特性等理化性质是口服制剂的制备所需要的参数(Tang et al, 2020); 糖醛酸含量、硫酸基含量与类肝素活性相关。因此, 本研究将以不同分子量海蚌类肝素G2、DG1、DG2为对象, 进一步测定海蚌类肝素的理化性质, 并评价它们的抗血栓活性, 以期为开发海洋源类肝素及其口服制剂提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同分子量海蚌肝素, 本课题组自制; 硼砂、咔唑、三氯乙酸, 上海麦克林试剂公司; 硫酸钾、氯化钡、浓硫酸, 广州化学试剂厂; 明胶, 广东光华科技股份有限公司; D-葡萄糖醛酸, 上海源叶生物科技有限公司; 浓盐酸, 廉江市爱廉化试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Nano-ZS90马尔文粒径仪, 英国malvern有限公司; HAAKE MARSⅢ流变仪, 美国Thermo Fisher Scientific公司; TA Q2000差示扫描量热仪, 美国TA公司。

1.3 方法

1.3.1 不同分子量海蚌类肝素的理化性质分析

1.3.1.1 化学组成分析

采用改良的硫酸-咔唑法测定葡萄糖醛酸的含量(Bitter et al, 1962); 采用 BaCl2-gel 比浊法测定硫酸基的含量 (Dodgson et al, 1962; 侯萍, 2018)。

1.3.1.2 粒径及电位分析

配制浓度为0.01mg·mL-1的不同分子量海蚌类肝素G2、DG1、DG2溶液, 充分溶解后过0.2μm的滤膜, 在粒径及 Zeta 电位仪上进行测量, 实验重复3次, 取均值。Zeta电位是指样品溶液表面所带静电荷的电位。

1.3.1.3 热稳定性分析

采用同步热分析仪在50mL·min-1的N2气氛、 20~600℃温度范围内、10℃·min-1 的升温速率条件下对肝素标准品、G2、DG1和DG2样品进行热失重(Thermogravimetry, TG)和差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimeter, DSC)分析。

1.3.2 不同分子量海蚌类肝素的抗血栓活性评价

实验小鼠被随机分为12组(n=12): 空白组(B组); 阳性对照肝素组(Y组); 模型组(M组); 低、中、高剂量的G2组(G2L、G2M和G2H组); 低、中、高剂量的DG1组(DG1L、DG1M和DG1H组); 低、中、高剂量的DG2组(DG2L、DG2M和DG2H组)。不同分子量海蚌类肝素的低、中、高剂量组分别给予10mg·kg-1、20mg·kg-1和 40mg·kg-1的不同分子量海蚌类肝素。B组和M组的小鼠用等量的正常盐水灌胃。Y组的小鼠以20mg·kg-1的肝素钠灌胃。持续灌胃样品5d后, 除B组外的所有组别腹腔注射50mg·kg-1角叉菜胶。继续灌胃2d。在造模48h后, 用游标卡尺测量小鼠整个尾巴的长度和血栓形成的黑尾巴长度, 然后计算小鼠的黑尾巴比率。灌胃期间每天称一次小鼠的体重。第7天灌胃后断食不断水2h后, 所有小鼠被麻醉并安乐死, 拍照记录各组小鼠的黑尾情况。收集尾部组织并进行HE切片染色观察, 然后收集脏器, 称重, 计算脏器指数。黑尾比率、脏器指数分别利用以下公式计算:
黑尾比率= (A1/A2)×100%
式中: A1为黑尾长度; A2为整个尾巴的长度。
脏器指数= (Wv/Wb)×100%
式中: Wv为小鼠各脏器的重量; Wb为小鼠处死当天的体重。

1.3.3 不同分子量海蚌类肝素的出血效应评价

小鼠随机分为11组, 每组10只, 设空白对照组(B组)、肝素钠组(HP组)(20mg·kg-1), 以及G2、DG1和DG2的高、中、低剂量组。每组分别尾静脉注射10mL·kg-1样品。不同分子量海蚌类肝素的低、中、高剂量组分别给予10mg·kg-1、20mg·kg-1和40mg·kg-1的不同分子量海蚌类肝素。B组的小鼠用等量的盐水注射; HP组的小鼠注射20mg·kg-1的肝素钠。注射 30min后, 在距小鼠尾尖 3mm处剪断尾巴。将断尾放于室温下装有生理盐水的离心管中, 从小鼠断尾开始, 观察小鼠尾部出血情况, 直至无出血, 记录出血时间(Choi et al, 2015)。

1.4 统计学处理

试验结果均以均数±标准偏差$(\bar{x}\pm s)$表示; 组间差异采用t检验及方差分析方法进行统计分析, 当检验水平为P<0.05时有统计学意义。采用 SPSS 20.0软件进行数据分析, Origin Pro 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 不同分子量海蚌类肝素的理化性质分析

2.1.1 化学组成

肝素属于糖胺聚糖家族, 由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸, IdoA和D-葡萄醛酸, GlcA)和氨基己糖(a-D氨基萄糖, GlcN)及其衍生物(乙酰化、硫酸化)组成的具有不同链长的硫酸多糖混合物, 硫酸基可出现在糖醛酸上, 也可出现在氨基己糖上(凌沛学 等, 2015)。研究表明, 硫酸基(郑必胜 等, 2021)和糖醛酸(Radoff et al, 1985)含量对多糖的活性具有重要的意义。由表1可知, 与降解前相比, DG1、DG2 硫酸根含量分别升高了6.67%和9.06%, 糖醛酸含量分别降低了4.79%和11.85%。Mou等(2018)同样采用H2O2-VC降解法降解海参糖胺聚糖HmG获得了DHmG-1、DHmG-2、DHmG-2, 并对它们的化学组成进行了分析, 结果发现降解对硫酸基的影响较小, 但降低了糖醛酸的含量, 推测这可能是因为OH• 的降解以糖醛酸为目标, 而对硫酸酯类几乎没有攻击。
表1 不同分子量海蚌类肝素化学组成分析

Tab. 1 Chemical composition analysis of clam heparinoid with different molecular weights

样品名称 硫酸基含量/% 糖醛酸含量/%
G2 18.07±1.28 27.17±1.57
DG1 24.74±0.64 22.38±0.93
DG2 27.33±2.22 15.32±3.23

2.1.2 粒径及电位

从图1及表2可看出, G2主要分布在 50~2000nm, DG1主要分布在50~1700nm, DG2主要分布在15~1500nm, 少部分分布在 3000~7000nm. G2、DG1、DG2的平均粒径分别为262.3nm±5.3nm、183.9nm±6.2nm、152.8nm±10.6nm, PDI均小于1, 溶液分散性好。不同分子量海蚌类肝素的平均粒径与分子量呈正相关关系。G2、DG1及DG2 的 Zeta电位分别为-31.8mV±1.6mV、-25.1mV±1.0mV、-17.9mV ±0.6mV。随着降解分子量的降低, Zeta电位升高。严尚隆等(2021)通过超声辅助H2O2-VC法降解长松藻多糖也得到了类似的结果。这些结果表明不同分子量海蚌类肝素均为阴离子混合物, 随着降解程度的升高, 海蚌类肝素粒径降低, 分子间静电斥力增强, 海蚌类肝素溶液从聚集趋向分散, 从而更易于被吸收(曾凡珂 等, 2022)。这可能是因为降解处理使海蚌类肝素链断裂而暴露出更多基团, 使分子静电斥力增强所导致的(陈观兰 等, 2021)。
图1 不同分子量海蚌类肝素的粒径分布图

Fig. 1 Particle size distribution of different molecular weights clam heparinoid

表2 不同分子量海蚌类肝素的粒径、PDI及电位分析结果

Tab. 2 Particle size, PDI, and potential analysis of different molecular weights clam heparinoid

样品名称 粒径/nm PDI Zeta电位/mV
G2 262.3±5.3 0.467±0.0218 -31.8±1.6
DG1 183.9±6.2 0.429±0.0339 -25.1±1.0
DG2 152.8±10.6 0.444±0.0169 -17.9±0.6

2.1.3 热稳定性

G2、DG1和DG2的TG和DSC分析结果如图2所示。根据TG-DSC曲线显示, G2、DG1和DG2在90~230℃温度区间内发生了较小的质量损失(G2: 11.13%; DG1: 1.90%; DG2: 13.41%)且均在80℃左右出现一个吸热峰, 水分的蒸发和内部非晶体部分发生熔化可能是这一质量损失和能量变化的原因。此外, 在 230~600℃ 之间发生了较大的质量损失(G2: 35.28%; DG1: 6.51%; DG2: 35.17%), 260℃附近均出现一个放热峰, 在此温度范围内的质量及能量变化可能是多糖分子的热解聚和热降解造成的(杨东达, 2020)。G2、DG1和DG2的初始降解温度分别为240℃、246℃和187℃。以上结果表明, G2、DG1和DG2的初始降解温度均在180℃以上, 热稳定性良好。以初始降解温度及质量损失情况为指标, 可以看出随着分子量的降低, 不同分子量海蚌类肝素的热稳定性先升高后降低。
图2 不同分子量海蚌类肝素G2(a)、DG1(b)、DG2(c)的TG-DSC曲线

Fig. 2 TG-DSC curves of clam heparinoid G2 (a), DG1 (b), and DG2 (c)

2.2 不同分子量海蚌类肝素的抗血栓活性评价

2.2.1 不同分子量海蚌类肝素对小鼠体重的影响

研究表明, 营养成分、毒物、药物以及其他因素对动物作用的最终效果大多数都可通过体重变化或生长发育反映出来(周艳霞 等, 2021)。如表 3 所示, 在 7d的灌胃期间, 各组平均体重呈增长状态, 且各组体重增长差异不明显(P>0.05)。在适应性灌胃7d后(未灌胃样品前), 各组间体重无明显差异(P>0.05)。经过灌胃样品 7d后, 各组体重均明显有增加(P<0.05), 但各组间小鼠体重没有显著性差异(P>0.05), 说明小鼠的正常生长不受不同分子量海蚌类肝素或肝素钠影响。

2.2.2 不同分子量海蚌类肝素对小鼠脏器指数的影响

动物体内的脏器是机体各项生理功能的执行者, 通过检测脏器指数(viscera index)可发现动物是否发生病理性改变(Deng et al, 2015)。角叉菜胶可用于制备多种组织炎症模型(李赛丽 等, 2018), 也可用于血栓模型造模。角叉菜胶血栓模型造模机制为促发炎症, 损伤血管内皮细胞, 激活凝血系统, 促进血栓形成, 同时抑制纤溶系统溶解血栓而使病理性血栓形成(肖素军 等, 2018)。根据图3所示, 相对于空白对照组(B组), 模型组(M组)小鼠的心、肝、肺、脾和肾脏器指数出现不同程度的增大, 其中肝脏与肺指数显著增大(P<0.05)。相对于M组, 阳性对照组(Y组, 阳性药物为肝素钠)小鼠的心、肝、脾、肾和肺指数均降低, 但仅肝脏与肺指数显著降低(P<0.05)。G2各剂量组的心、肝、脾、肾、肺指数均低于M组, 且与剂量呈正相关关系, 其中G2L组(10mg·kg-1)的脾、肺指数显著降低(P<0.05)。DG1各剂量组的心、肾和肺指数与剂量呈正相关关系, 而肝指数与剂量则呈负相关关系。其中, DG1H组的肝指数和DG1M组的脾指数显著低于M组(P<0.05); DG1L (10mg·kg-1)、DG1M(20mg·kg-1)和DG1H (40mg·kg-1)组的肺指数均显著低于M组(P<0.05)。DG2各剂量组的肝指数均显著低于M组, 肺指数均低于M组, 但仅DG2H组的肺指数显著低于M组。以上结果说明角叉菜胶造模使小鼠内脏发生病理变化, 其中以肝、肺最为严重。阳性药物肝素钠、海蚌类肝素G2、DG1和DG2均可缓解小鼠在受到角叉菜胶的刺激后, 炎症、血栓形成导致的脏器损伤, 但可能因为脏器指数的变化受很多因素的影响, 它们的对血栓小鼠脏器损伤的缓解作用还与作用剂量相关。
图3 各实验组尾部血栓小鼠脏器指数

图中##表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01), *表示与模型组相比差异显著(P<0.05), **表示与模型组相比差异极显著(P<0.01)

Fig. 3 Viscera index of mice with tail thrombosis in each experimental group

表3 实验前后小鼠体质量的变化(n=12)

Tab. 3 The changes of mice body weight before and after the experiment (n=12)

组别 W0/g W7/g
B 25.3±3.4 32.8±2.5*
M 23.8±3.0 32.9±2.6*
Y 24.6±2.5 34.6±3.5*
G2L 24.6±3.5 33.4±1.9*
G2M 25.6±3.1 34.0±2.6*
G2H 24.5±2.9 33.6±1.9*
DG1L 24.0±3.0 34.8±2.2*
DG1M 23.6±2.2 35.6±2.7*
DG1H 24.4±3.3 33.0±2.4*
DG2L 24.4±3.5 33.6±3.0*
DG2M 23.9±3.8 32.1±1.8*
DG2H 23.9±3.2 31.6±3.4*

注: W0为适应性灌胃7d后小鼠的体重, W7为灌胃样品7d后小鼠的体重; * 表示与W0相比较差异显著(P<0.05)

2.2.3 不同分子量海蚌类肝素对小鼠尾部血栓形成的影响

在角叉菜胶的作用下, 单血管供血小鼠的尾部产生血栓并以黑尾的形式明显地呈现出来。由图4a、4b可知, B组尾部正常, M组尾部出现明显黑尾。此外, 从图4c、4b可知 B组的尾静脉空腔并没有被血栓充满, 而M组的尾静脉空腔中则充满了血栓。综上可知, 小鼠黑尾血栓模型造模成功。
图4 造模48h后空白对照组(a、b)与模型组(c、d)的小鼠黑尾照片及其尾部组织病理学检查结果(HE染色, × 40)

Fig. 4 Photographs of black tails of mice in the blank control group (a) and the histopathological findings of their tails (HE staining, ×40) (b), and photographs of black tails of mice in the model control group (c) and the histopathological findings of their tails (HE staining, ×40) (d) 48h after carrageenan treatment

采用小鼠黑尾比率即黑尾与全尾长度的比值来量化小鼠的尾部血栓形成情况, 并排除小鼠尾长的个体差异。由表4可以看出, 注射角叉菜胶48h后, M、Y、DG2L和DG2H组小鼠的黑尾比率比注射角叉菜胶24h后的小鼠黑尾比率略为增加, 而G2、DG1的各剂量组和DG2M组的小鼠黑尾比率比注射角叉菜胶24h后的小鼠黑尾比率略为降低。这说明海蚌类肝素G2及DG1对小鼠黑尾血栓具有一定的治疗作用(Li et al, 2018)。注射角叉菜胶24h、48h后, G2、DG1和DG2的低、中和高组的小鼠黑尾比率均低于M组, 并与剂量呈正相关关系。其中, G2和DG1的中、高剂量组(分别为20mg·kg-1、40mg·kg-1)的小鼠黑尾比率显著低于M组(分别为P<0.01、P<0.05), 说明海蚌类肝素G2、DG1可以抑制小鼠体内血栓的形成, 并具有预防作用(Bekemeier et al, 1985; 刘海韵 等, 2020)。此外, 肝素钠、G2、DG1在20mg·kg-1剂量下对黑尾血栓形成的抑制效果接近。但在40mg·kg-1剂量下, 抗血栓能力DG1>G2>DG2(P<0.05)。这可能是因为一定程度的降解分子保留了肝素的活性基团和基本结构而暴露了更多的活性基团, 改变了高级结构, 为海蚌类肝素的活性发挥提供了更多空间所致(陈观兰 等, 2021), 此外也可能与肠道菌群的吸收利用有关(Chen et al, 2022)。
表4 角叉菜胶处理后24h、48h各实验组的小鼠黑尾比率

Tab. 4 Blacktail ratio of mice in different treatment groups at 24h, 48h after carrageenan treatment

组别 黑尾比率/%
24h 48h
B 0±0 0±0
M 52.03±5.46## 57.73±8.89##
Y 28.92±0.56** 33.01±1.61**
G2L 48.67±2.78 45.39±4.43
G2M 35.01±1.41** 33.32±2.09**
G2H 31.30±3.23** 30.83±4.34**
DG1L 46.91±5.27 45.05±3.88
DG1M 36.96±3.19* 34.31±1.68**
DG1H 19.94±5.26** 18.70±2.82**
DG2L 47.82±5.67 49.16±4.71
DG2M 47.30±4.70 47.25±6.61
DG2H 43.95±6.54 45.00±5.42

注: 表中##表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01), *表示与模型组相比差异显著(P<0.05), **表示与模型组相比差异极显著(P<0.01)

2.2.4 不同分子量海蚌类肝素对小鼠出血时间的影响

用尾部横断出血时间来研究肝素钠、G2、DG1和DG2的出血副作用, 结果如图 5所示。与Blank组相比, G2在20mg·kg-1和40mg·kg-1时、DG1在20mg·kg-1和40mg·kg-1时的出血时间明显延长, 这表明G2和DG1能影响小鼠体内的凝血功能。此外, 肝素钠可引起严重的出血时间延长(G2为2533.33s±203.72s, DG1为236.67s±32.56s)。与阳性对照肝素钠相比, G2、DG1和DG2在实验剂量范围内的延长出血时间作用明显较低(P<0.01), 而且与剂量和分子量呈正相关关系。联合抗血栓评价的结果, 说明海蚌源类肝素的出血副作用较低, 而且适度降解可维持海蚌类肝素的抗血栓活性, 同时也有效地降低了出血风险。此外, 由于海蚌类肝素通过灌胃和注射的抗血栓作用途径可能不一样(Zhao et al, 2016), 因此还需进一步通过动物实验去探究灌胃海蚌类肝素的出血副作用。
图5 不同分子量海蚌类肝素的血块溶解能力比较

图中##表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01), *表示与模型组相比差异显著(P<0.05), **表示与模型组相比差异极显著(P<0.01)

Fig. 5 Comparison of clot solubility of clam heparinoid with different molecular weights

3 讨论

血栓性疾病是指因病理性血栓在血管中阻塞血管或随着血液的流动而栓塞血管引起的缺血性脑卒中、冠心病、下肢静脉血栓、肺栓塞等易致残致死的疾病。肝素于1935年开始被作为抗凝剂应用于临床治疗血栓, 至今仍然是常用的抗凝剂。此外, 肝素以肠外途径给药, 因为其较低的口服生物利用度, 通常被认为不具有口服抗血栓活性。口服简便, 患者易依从。虽市面上有维生素K、达比加群、利伐沙班、阿呱沙班和依多沙班等口服抗凝剂, 但肝素仍然是最有效的抗凝剂(Neves et al, 2016), 因此高口服活性的肝素口服制剂急需研发。
口服制剂的制备与理化性质密切相关。本文测定了不同分子量海蚌类肝素G2、DG1和DG2的硫酸基含量、糖醛酸含量、粒径、Zeta电位及热稳定性, 结果表明不同分子量海蚌类肝素G2、DG1和DG2的硫酸基含量均在18%以上, 糖醛酸含量均在15%以上, Zeta电位均在-17.9mV以下, 粒径均小于150nm, 并与分子量测定结果具有相同的趋势, 初始热降解温度均在187℃以上。因此, 这些结果说明不同分子量海蚌类肝素均是具有较高硫酸基和糖醛酸含量、易溶于水、易于被生物吸收利用, 以及热稳定性强的阴离子多糖。
此外, 前期体外研究表明, 不同分子量海蚌类肝素具有抗血栓潜力, G2具有较高的抗凝活性, DG1具有较高的抗Ⅱa/Ⅹa值, DG2具有较高的纤溶活性(陈观兰 等, 2021; Chen et al, 2022)。本文进一步通过小鼠黑尾模型研究了它们的经灌胃抗血栓活性, 以筛选出具有较高抗血栓活性的样品。结果表明, G2、DG1和阳性药物肝素钠在20mg·kg-1和40mg·kg-1剂量时可显著降低小鼠的黑尾比率; 通过比较20mg·kg-1和40mg·kg-1剂量下G2和DG1组的小鼠黑尾比率, 发现DG1比G2具有更强的抗血栓活性。这说明G2、DG1和阳性药物肝素钠经灌胃给药具有抗血栓活性, 适当降解可提高海蚌类肝素的口服抗血栓活性。DG1在40mg·kg-1剂量下的血栓小鼠的黑尾比率降低了61.68%, 而同等剂量下猕猴桃根多糖将血栓小鼠的黑尾比率降低了53.32%(肖素军 等, 2018)。此外, 脏器系数、体重变化及小鼠断尾出血时间在本研究中也被用于初步探究样品的生物安全性。探究结果表明, 具有肠内抗血栓活性的类肝素G2和DG1并不影响小鼠的正常生长, 可缓解小鼠在受到角叉菜胶刺激后因炎症、血栓形成而导致的脏器损伤; 同时, 相对于肝素钠, 小鼠断尾出血时间显著降低。这初步表明类肝素G2和DG1通过肠内给予对机体不具有明显的危害,且相对于肝素钠可能具有更宽的给药剂量范围。
本文的研究为开发具有海蚌类肝素的口服活性制剂奠定了一定的基础。但不同分子量海蚌类肝素的肠内抗血栓活性还需通过大鼠颈动脉血栓模型、小鼠肺栓塞模型等血栓模型进一步验证, 抗血栓机制还需通过酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、蛋白印迹(western blot, WB)等手段进一步探究, 代谢动力学和生物利用度等肠内活性影响因素也需进一步测定。

4 结论

1) 理化性质分析: 随着分子量的降低, 硫酸基含量升高(G2: 18.07%、DG1: 24.74%、DG2: 27.33%), 但糖醛酸含量降低(G2: 27.17%、DG1: 22.38%、DG2: 15.32%); 热稳定性先升高后降低(初始降解温度: G2: 240℃、DG1: 246℃、DG2: 187℃); 粒径降低(G2: 262.3nm、DG1: 183.9nm、DG2: 152.8nm), Zeta 电位升高(G2: -31.8mV、DG1: -25.1mV、DG2: -17.9mV)。
2) 抗血栓活性评价和对出血时间的影响: 相对于海蚌类肝素G2, 其适度降解产物DG1具有更高的抑制尾部血栓形成的能力, 同时具有较低的出血风险。

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