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Journal of Tropical Oceanography >

2023 , Vol. 42 >Issue 5: 76 - 91

DOI: https://doi.org/10.11978/2022216

Marine Biology

Distribution of the microbial Carbohydrate-Active enzymes genes in the surface sediment of the Daya Bay, China

  • SUN Cuici , 1, 2 ,
  • YUE Weizhong 3, 4 ,
  • ZHAO Wenjie 1, 5 ,
  • WANG Youshao , 1, 2
Expand
  • 1. State Key Laboratory of Tropical Oceanography (South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences), Guangzhou 510301, China
  • 2. Daya Bay Marine Biology Research Station (Chinese Academy of Sciences), Shenzhen 518121, China
  • 3. Marine Environmental Center (South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences), Guangzhou 510301, China
  • 4. Yangjiang Offshore Wind Power Laboratory, Yangjiang 529500, China
  • 5. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
WANG Youshao. email:

Received date: 2022-10-10

  Revised date: 2022-11-22

  Online published: 2023-01-09

Supported by

National Natural Science Foundation of China(42073078)

National Natural Science Foundation of China(U1901211)

Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation(2020A1515011137)

National Key Research and Development Program of China(2017FY100707)

Fold

Abstract

The microbial carbohydrate active enzymes (CAZymes) are important in the process of carbohydrate mineralization in marine sediment. In this study, metagenomic analysis is used to identify microbial CAZymes genes and predict glycan utilization in the surface sediments from the Daya Bay in spring. The microbial communities showed specific utilization for the different structure glycans. Delta-proteobacteria were dominant for encoding CAZymes genes for the degradation of peptidoglycan and chitin. Gammaproteobacteria, Bacteroides and Planctomycetes were the dominant groups encoding CAZymes genes for the degradation of complex polysaccharides (fucoidan, laminarin, cellulose and hemicellulose), which was associated with their highest Shannon diversity of CAZymes families. Acidobacter was the primary contributors of CAZymes genes for cleaving oligo-galacturonic acid. The contributions of Archaea to most CAZymes genes were less than 1%, while their contributions of genes encoding carbohydrate esterase, binding module relating cellulose and hemicellulose degradation ranged from 2.18 %to11.1%. According to the functional of glycoside hydrolases, the substrate of CAZymes were mostly derived from autochthonous debris, i.e., bacterial sugars (peptidoglycans and α- glucan), algal cell wall (fucoidan and laminarin) and chitin. The relative abundances of CAZymes genes in the mouth for the algal derived organic debris with complex chemical structure were higher than those in the east-northern of the bay. The relative abundances of Auxiliary Activity families (AAs) genes related to lignin degradation were the highest in the east-northern of the bay, and their dominant AAs may help to increase lignocellulose solubility and subsequently enhance the bioavailability of GHs to lignocellulose. The compositions of CAZymes genes were mainly related to the particulate organic matter deposition from water columns and the depth of water body.

Key words： microbial community; carbohydrate-active enzymes genes; sediment; metagenome; Daya Bay

Cite this article

SUN Cuici , YUE Weizhong , ZHAO Wenjie , WANG Youshao . Distribution of the microbial Carbohydrate-Active enzymes genes in the surface sediment of the Daya Bay, China[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2023 , 42(5) : 76 -91 . DOI: 10.11978/2022216

近岸海湾海域生产力高, 沉降作用导致上层水体中富含各类多糖的藻类植物和动物残骸、有机碎屑以及陆源有机输入在沉积物中富集, 为沉积物中的微生物提供了重要的有机碳源(Orsi et al, 2018; Zheng et al, 2021)。海洋微生物在碳水化合物的分解与合成过程中发挥关键作用, 该过程受作用于各种糖复合物、寡糖和多糖等碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes, CAZymes)介导(Zhang et al, 2018)。
海洋中微生物群落产生的多糖水解酶的酶谱(针对底物)和酶活速率随空间分布和深度而变化, 并且可以在聚集体形成等过程中发生变化(Balmonte et al, 2021)。水体中参与多糖降解的微生物群落包括异养γ-变形菌(快速生长的机会主义者), 能够迅速适应不断变化的可利用底物; 拟杆菌门成员在自然水华发生过程中以及实验室培养浮游植物爆发期迅速增殖(Teeling et al, 2012; Ben Francis et al, 2021)。另外在α-变形菌中, 具有代谢多样性的玫瑰杆菌群落在近岸水域特别丰富, 通常在浮游植物和颗粒物中丰度较高(Arnosti et al, 2021)。在富含有机物的海洋沉积物中, 底栖细菌的系统发育组成和生理代谢与水体中差异较大, 底栖群落更适应于广泛的厌氧碳降解途径, 可有效协同降解复杂的有机底物(Hoshino et al, 2020)。
近年来研究人员采用“组学”技术对CAZymes数据深度挖掘, 在破译胞外聚合分泌物与微生物相互关系方面有了新的突破(Teeling et al, 2012; Xing et al, 2015; Smits et al, 2017)。不同菌群对糖的代谢能力和途径存在差异, 在水华不同发育期中CAZymes组成表现出类指纹模式(Teeling et al, 2012; Teeling et al, 2016), 表现出独特的“糖生态位”(Francis et al, 2021)。Silvia Vidal-Melgosa等(2021)结合组学分析和糖基微阵列糖芯片技术, 追踪大西洋北海硅藻赤潮爆发期间, 不同化学组成糖类以及微生物CAZymes变化, 发现CAZymes中参与昆布多糖降解酶丰度远高于参与岩藻聚糖降解酶, 导致岩藻聚糖大量富集, 该研究验证了岩藻聚糖为惰性很强的多糖种类。岩藻聚糖多具有硫酸分支而具有黏性, 是透明胞外聚合颗粒物的主要化学成分之一, 可以通过凝集与吸附颗粒物增加海洋有机碳沉降通量, 促进上层初级生产的有机碳向深层输运(Burd et al, 2009), 因此在沉积物中可能有大量岩藻聚糖富集, 并对增加碳储存具有潜在作用。Sichert等(2020)在褐藻栖息地收集到的一株疣菌门(Verrucomicrobiae)细菌Lentimonas sp., 根据基因组数据分析参与岩藻聚糖降解的CAZymes酶高达284种(包括糖苷水解酶和碳水化合物酯酶和硫酸酯酶)。虽然近些年人们对海洋微CAZymes功能认知不断加深(Xing et al, 2015; Koch et al, 2019; Sichert et al, 2020), 但野外环境中CAZymes仍有很多未知或未被表征, 特别是与上层水体中类似的研究相比, 海洋沉积物中细菌CAZymes的生态多样性组成相关研究较少(Andrade et al, 2017; Orsi et al, 2018; Arnosti et al, 2021)。
本研究选取大亚湾海域沉积物为研究对象, 开展微生物(细菌和古菌)碳水化合物活性酶生态多样性研究, 确定CAZymes酶类组成及其在不同群落中的分布特征, 对于理解微生物内部复杂的生态相互作用具有重要意义, 同时有助于厘清对近海沉积物中复杂的碳循环过程。

1 材料与方法

1.1 调查海域及站位

大亚湾是我国典型的亚热带半封闭海湾, 是南海北部向陆地延伸最深的海湾。本研究于2020年4月30日在大亚湾海域设置3 个采样点, 站点经纬度见表1, 其中S1站点设于受外海和珠江冲淡水影响明显的湾口; S5站点设于大亚湾中部核电站附近海域; S11站点设于水动力较弱且沿岸有红树林分布的湾东北部。调查船为粤海渔11094号, 现场使用抓斗采泥器采集表层沉积物, 一部分样品(约100g)立即放置-18℃冰箱冷冻, 后期用于环境参数分析, 另一部分样品(约15g)用液氮保存用于宏基因组分析。
表1 调查期间大亚湾3个站位理化因子

Tab. 1 Physical parameters during the sampling time

站位 S1 S5 S11
经度 114°37′59.88″E 114°33′42.12″E 114°43′0.12″E
纬度 22°31′59.88″N 22°35′35.88″N 22°46′0.12″N
水深/m 19.5 13.5 8.0
含水率/% 38.2 35.1 62.4
砂土百分比/% 13.4 5.9 0
粉砂土百分比/% 64.9 71.9 62.7
黏土百分比/% 21.7 22.2 37.54
平均粒径/μm 6.4 6.4 7.59
中值粒径/μm 6.6 6.3 7.49
总有机碳(TOC)/(%·g-1) 0.50±0.02 0.47±0.01 1.63±0.05
硫化物含量/(μg· g-1) 33.41±1.12 81.8±2.37 218.7±5.49
总磷(TP)/(mg·kg-1) 160.5±8.27 130.7±5.18 142.4±6.76
总氮(TN)/(mg·kg-1) 214.5±8.1 248.8±9.3 441.6±12.8
TOC : TN 27.3 22.0 43.1
水体叶绿素浓度/(μg·L-1) 1.47 1.51 1.76

1.2 理化性质分析

环境理化参数包括沉积物含水率、粒径、总有机碳(total organic carbon, TOC)、总氮(total nitrogen, TN)、总磷(total phosphorus, TP)、硫化物和水体叶绿素含量。叶绿素、TN/TP、TOC、硫化物以及含水率测定分别采用《海洋监测规范》(GB17378.5—2007) (中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局和中国国家标准化管理委员会, 2007)中的丙酮提取法、过硫酸钾消化法、重铬酸钾氧化-还原容量法、亚甲基蓝分光光度法和重量法。粒度分析采用英国马尔文公司astersizer2000型激光衍射粒度分析仪。

1.3 宏基因组数据分析

使用DNA提取试剂盒(MP Biomedical, Cleveland, 美国)进行沉积物DNA提取, 使用NanoDrop 2000分光光度计评估DNA提取物的质量和完整性; 采用Illumina HiSeq 2500 高通量测序平台进行PE150 测序, 该序列在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)库的登录号为: PRJNA884008。筛选拼接长度在500bp 以上的Scaftigs进行后续分析。采用MetaGeneMark来预测开放阅读框(open reading frame, ORF), 评估预测ORFs的数目、长度等。采用FASTQC v0.11.8和Trimmomatic对序列进行质控和评价(Davis et al, 2013; Bolger et al, 2014)。采用Linclust软件进行基因聚类及去冗余。将非冗余基因集的序列与NCBI-NR 数据库比对进行物种注释, 获得物种注释信息, 并结合基因丰度表获得各个分类层级的物种组成和丰度信息。使用dbCAN2中HMMER软件基于隐马尔科夫模型注释CAZymes (Zhang et al, 2018)。使用BLASTP将已注释获得的CAZymes基因序列重新比对NR数据库(阈值为1×10-5), 使用物种注释软件Metagenome Analyzer (MEGAN)对上述比对结果进行物种注释, 获取CAZymes序列在不同物种中分布信息(Andrade et al, 2017)。根据底物进行CAZymes功能分类, 参照CAZy库(http://www.cazy.org)和文献Cantarel等(2012)、Orsi等(2018)。计算每千碱基每百万的读取数值RPKM (reads per kilobase per million mapped reads), RPKM = 106×(映射的读取数/千碱基对中的基因长度)/样本中的读取数, 估计单个基因家族的归一化相对丰度。
CAZymes的α-多样性以香浓指数(Shannon diversity)来表示(Baltar et al, 2021)。采用限制性主坐标分析(constrained principal coordinate analysis, CPCoA)方法分析CAZymes家族在不同群落中的分布差异。

2 结果

2.1 环境特征

大亚湾采样站点表层沉积物环境参数以及水体中叶绿素浓度的结果列于表1。沉积物中总氮(TN)含量介于214.5~441.6mg·kg-1之间, 平均含量为301.6mg·kg-1; 沉积物中总有机碳(TOC)含量在每克干重的0.47%~1.63%之间, 平均含量为0.87%; S11站TOC、TN、硫化物以及含水量最高, TOC : TN亦高于其他两站。大亚湾表层沉积物以粉砂与黏土质为主, 中值粒径小。3个站位间的水体叶绿素浓度介于 1.47~1.76µg·L-1之间, 分布较均匀。

2.2 物种组成

通过宏基因组数据分析发现, 调查期间细菌和古菌的物种比例分别为80%和2%, 真核生物(主要为真菌)约占1%。图1为不同微生物群落在原核微生物[古菌、细菌和病毒(archaea, bacteria, and virus, ABV]中所占比例分布图。变形菌门在细菌中占主导地位, 平均占原核微生物的53.37%, 在纲级别上, δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria, 24.90%)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria, 22.17%)占据最大优势(图1), 在目分类级别上, 属于δ-变形菌纲的脱硫杆菌科(Desulfobacteraceae)为最大优势菌群, 占原核微生物群落的14%。另外超过1%的类群有绿弯菌门(Chloroflexi, 5.74%)、酸杆菌门(Acidobacteria, 5.24%)、浮霉菌门(Planctomycetes, 2.87%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 1.53%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae, 1.21%)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes, 1.15%)(图1)。虽然3个站点具有相似的群落组成, 但δ-变形菌纲在硫化物和有机质丰富的S11站位具有较高的相对丰度, 而γ-变形菌纲和绿弯菌门的分布呈湾外向湾内逐渐降低趋势。
图1 细菌门微生物群落在原核微生物中的百分比分布

Fig. 1 The compositions of bacterial communities in the surface sediment of the Daya Bay in the phylum level

2.3 CAZymes种类组成

直接参与碳水化合物降解的酶包括糖苷水解酶类(glycoside hydrolase, GHs)、多糖裂解酶类(polysaccharide lyases, PLs)和碳水化合物酯酶类(carbohydrate esterases, CEs), 此次调查编码三者的基因序列在CAZymes序列总丰度中占比分别为26.54%、2.40%和16.92%。一般而言, CAZymes中碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding modules, CBMs)附加在糖苷水解酶上可增强糖苷酶催化活性, 虽然CBM本身不具催化活性, 但在大亚湾沉积物中占有相当比例, 为总CAZymes基因总丰度的16.75%。PLs主要功能为裂解含酸性基团(糖醛酸或硫酸基团)的多糖, 然而编码PLs基因的相对丰度比GHs、 CBMs 和 CEs 序列低一个数量级。此外, CAZymes中涉及碳水化合物合成的酶类被归为糖基转移酶类(glycosyltransferases, GTs), 此次调查GTs序列占比31.10%。辅助模块酶类(auxiliary activities associated with polysaccharide and lignin degradation, AAs)功能为参与各种氧化还原转化反应, 该类序列在沉积物中的占比较小为6.29%。与糖类降解直接相关的大类之和Σ(GHs+CBMs+ CEs+PLs)在宏基因组中频率平均为0.66%。用dbCAN中hmmer软件对大亚湾沉积物微生物的碳水化合物酶(CAZymes)注释后, 共获得275个CAZymes家族种类, 其中包含100种糖苷水解酶(GHs), 68种糖基转移酶(GTs), 65种碳水化合物结合模块(CBMs), 18种多糖裂解酶(PLs), 16种碳水化合物酯酶(CEs)和8种辅助模块酶类(AAs)。从整体来看, CAZymes大类上的分布在站位间较一致。图2为CAZymes序列的相对丰度值RPKM (在CAZymes总丰度中占比超0.5%以上的种类), 其中大部分GTs酶类和AAs序列的RPKM表现为S11站位最高, 而编码糖苷水解酶GH13、GH3、GH29、 GH33 、GH16、 GH78以及碳水化合物酯酶序列的相对丰度表现为湾口高于湾顶部的趋势(CAZymes酶的主要功能见补充表S1)。
图2 大亚湾沉积物中优势CAZymes种类的基因序列相对丰度(RPKM)

优势CAZymes种类指总丰度占比大于0.5%的CAZymes序列

Fig. 2 The relative abundances (RPKM) of the TOP CAZymes genes (> 0.5%)

以序列相对丰度占糖苷水解酶GHs序列总丰度>2%来划分, 糖苷水解酶家族中占据优势的水解酶序列丰度从大到小依次排序为GH23、GH13、GH3、GH29、GH33、GH109、GH130、GH16、GH5、GH77、GH103和GH78 (图3a)。丰度最高的糖苷水解酶GH23和GH103与肽聚糖(细菌细胞壁主要成分)代谢相关, 两者序列丰度在所有GHs丰度中百分比分别为16.7%和2.3% (图3a)。GH13 (α-1,4-D葡萄糖苷酶)在GHs中占10.9% (图3a), 其底物主要来源于细菌体内储存的α-1,4-D-葡聚糖。GH3 (寡聚β-葡萄糖苷酶)、GH16 (长链β-葡萄糖苷酶)和GH5都涉及β-葡聚糖降解(如昆布多糖和纤维素等), 三者序列丰度在总GHs基因序列中占比6.7%、3.3%和2.8% (图3a), 昆布多糖属于海洋水体中最为丰富的多糖之一, 多来源硅藻。编码GH29 (外切α-L-岩藻糖苷酶)、GH78 (鼠李糖苷酶)和GH130 (β-甘露聚糖酶)的序列丰度在GHs总丰度中百分比依次为5.2%、3.0%及1.9% (图3a), 三者水解酶参与降解的藻类细胞壁和细菌胞外分泌物主要存在于透明胞外聚合颗粒物(transparent exopolymer particles, TEP)和海洋雪中。另外本研究发现GH107 (岩藻聚糖内切酶)的序列存在于沉积物样品中, 但丰度远低于GH29和GH95, 在S11、S5和S3站位中编码GH107序列丰度在总GHs中百分比分别为0.012%、0.025%和0.025%。GH109为N-乙酰氨基己糖苷酶, 其底物为细菌细胞壁成分或几丁质寡聚糖, 作用于N-乙酰-β-D-己糖胺末端非还原N-乙酰-D-己糖胺残基的水解, 另外GH33主要功能为乙酰神经氨酸(唾液酸)水解酶, 负责寡糖、糖蛋白、糖脂、多香酸等底物中末端唾液酸残基α-(2→3)-、α-(2→6)-、α-(2→8)-糖苷键的水解, 其底物多来源于富含黏多糖的动物, 如胶质类浮游动物和鱼类等, 在沉积物中丰富的GH33反映了上层浮游动物或底栖动物等有机碳来源对表层沉积物CAZymes组成影响明显。
图3 参与碳水化合物降解的优势CAZymes序列组成分布

a. 糖苷水解酶基因(GHs); b. 碳水化合物酯酶基因(CEs); c. 多糖裂解酶基因(PLs); d. 碳水化合物结合模块基因(CBMs); e. 辅助模块酶类基因(AAs)

Fig. 3 Compositions of the dominant CAZymes genes in the surface sediment of the Daya Bay. (a) GHs; (b) CEs; (c) PLs; (d) CBMs; (e) AAs

碳水化合物酯酶序列的丰度依次为CE1、CE10、 CE4、 CE14、 CE7、 CE3、CE6及CE11
(图3b)。这些家族包含许多酶功能, 包括肽聚糖、木聚糖、几丁质和硫酸岩藻聚糖等多糖的脱乙酰化。另外CE1还包含了降解多聚物如聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate, PHB)解聚酯酶(图3b)。多糖裂解酶家族中编码PL22 (底物为寡聚半乳糖醛酸, 为果胶降解产物)序列丰度最高(图3c), 占据PLs序列总丰度的42.2%, 其次为编码PL9、PL1、PL12、PL15、PL14和PL6。PL22、PL9和PL1都涉及果胶裂解, 三者之和占总PLs丰度的72.9% (图3c), 而PL15、PL14和PL6为海藻酸裂解酶, PL12为肝素裂解酶。由此可知, 调查期间大亚湾表层沉积物中酸性多糖是以带半乳糖醛酸基团的果胶类酸性多糖为主, 而海藻酸多糖含量较低。碳水化合物结合模块(CBMs)附加在糖苷水解酶上可以增强糖苷酶催化活性, CBMs丰度排序依次为CBM50、CBM44、CBM48、CBM40、CBM9和CBM66 (图3d), 其指示意义包含了与肽聚糖结合的CBM50 (对应的水解酶为GH23、GH73)、与GH13的结合模块CBM48、涉及昆布糖、纤维素和半纤维素(β-葡聚糖和木聚糖)降解的结合模块CBM44和CMB9、与GH33结合的CBM40等。因此沉积物中CBMs的组成与糖苷水解酶家族优势种类组成在功能分布上具有吻合特征。
辅助模块酶类(AAs)类目前包括木质素分解酶家族和分解多糖单加氧酶家族。它们不会直接作用于碳水化合物, 但由于其始终与植物细胞壁中的碳水化合物(纤维素和半纤维素)密切相关, 因此CAZy数据库根据氨基酸序列相似性对这些酶在家族和亚家族中进行了分类, 旨在反映结构特征并促进基因组注释。此次调查发现在总CAZymes占比超过1%的3种AAs类序列有AA6、AA2和AA7 (低聚葡萄糖氧化酶), 其次是AA4 (香草醛醇氧化酶)。AA6 (31.9%)、AA2 (28.7%)和AA4 (11.1%)都参与了木质素降解。AA2家族是锰过氧化物酶, 是参加木质素降解的主要酶类之一(图3e)。木质素的结构是芳香族的高分子化合物, 芳香环基团被过氧化开环后会形成较多的苯醌基团, AA6家族酶的特征为1,4-苯醌还原酶, 催化由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)介导的对苯醌转化为对苯二酚, 中间过程产生过氧化物促进长链有机分子的氧化裂解, 可增加不可溶的木质素和纤维素等大分子在水体中的溶解性, 为纤维素水解酶提供更多的作用位点, 从而提高木质纤维素的降解效率。

2.4 CAZymes基因序列在微生物群落中的分布特征

图4为CAZymes家族在不同微生物群落(细菌和古菌)中的差异分布。根据CAZymes家族在不同群落中的香浓指数来表示其α-多样性, 结果表明CAZymes的α-生态多样性从高到低依次为浮霉菌门、拟杆菌门、γ-变形菌门、绿弯菌门、疣菌门、螺旋体门、δ-变形菌门、厚壁菌门及酸杆菌门(图4a), 且上述群落的α-生态多样性指数显著高于古菌、放线菌门和蓝细菌门等群落(p<0.001)。基于CPCoA分析表明大亚湾表层沉积物的CAZymes家族在群落中分布具有显著差异(解释率=91.3%, p=0.0001)(图4b), 并划分为3类, 第一类(Ⅰ)包括γ-变形菌门和δ-变形菌门, 这两个群落中富含溶菌酶(GH23、GH103、GH24、GH104、GH108)、淀粉水解酶(GH13、GH77、GH15)和降解β葡聚糖(GH3、GH1、GH16、GH81)为主的CAZymes类(图5); 第二类(Ⅱ)是具有高α-多样性的浮霉菌门、拟杆菌门、绿弯菌门和酸杆菌门(图4b), 该类中的CAZymes功能复杂, 包括降解纤维素(GH5、GH10、GH30)、半纤维素(GH43、GH74、GH62)、果胶(GH28、GH105)、岩藻聚糖(GH29、GH95)、蛋白聚糖(GH33、GH109)等具有复杂结构的大分子糖类CAZymes (图5); 第三类(Ⅲ)包括群落自身丰度或CAZymes的α-生态多样性两者最低的群落, 如蓝细菌门、Kiritimatiellaeota、古菌等(图4b)。
图4 基于CAZymes香浓指数(a)和CPCoA分析(b)

CAZymes家族在不同微生物群落(细菌和古菌)中的差异分布

Fig. 4 Shannon-diversity (a) and CPCoA analysis of CAZymes families (b) in the different prokaryotic groups (bacteria and Archaea)

Aci: Acidobacteria; Act: Actinobacteria; Arc: Archaea; Bac: Bacteroidetes; Chl: Chloroflexi; Cya: Cyanobacteria; Del: δ-proteobacteria; Fir: Firmicutes; Gam: γ-proteobacteria; Gem: Gemmatimonadetes; Kir: Kiritimatiellaeota; Nit: Nitrospirae; Pla: Planctomycetes; Spi: Spirochaetes; Ver: Verrucomicrobia; Kim: Kiritimatiellaeota

图5 GHs家族序列在不同群落中的差异分布

Fig. 5 GHs genes distributions in the different groups

Aci: Acidobacteria; Act: Actinobacteria; Arc: Archaea; Bac: Bacteroidetes; Chl: Chloroflexi; Cya: Cyanobacteria; P.Del: δ-proteobacteria; Fir: Firmicutes; P.Gam: γ-proteobacteria; Gem: Gemmatimonadetes; Kir: Kiritimatiellaeota; Nit: Nitrospirae; Pla: Planctomycetes; Spi: Spirochaetes; Ver: Verrucomicrobia; Kim: Kiritimatiellaeota

2.5 微生物群落降解不同结构聚糖的糖生态位分析

本文重点关注沉积物中糖类碳水化合物的降解, 因此研究侧重于糖苷水解酶类(GHs)、多糖裂解酶类(PLs)、碳水化合物酯酶类(CEs)和碳水化合物结合模块(CBMs)序列在微生物群落(细菌和古菌)中的分布特征及其功能预测。
δ-变形菌纲、γ-变形菌纲和绿弯菌门对细菌源的糖类碳水化合物降解贡献明显, 其中包括降解氨基聚糖(细菌细胞壁肽聚糖或几丁质)的GH23和CBM50, 以及降解细菌糖原α-1,4-D-葡聚糖的GH13和CBM48。变形菌门对编码GH23和GH13序列的贡献分别超过80%和50%以上, 其中δ-变形菌纲和γ-变形菌纲对GH23序列的贡献分别为38.88%和38.83%, 对GH13的贡献分别为24.15%和29.21%。其次绿弯菌门对GH13贡献高达12.34% (图6)。在目分类级水平上, δ-变形菌纲下的除硫单胞菌目(Desulfuromonadales)对GH23序列和其功能相匹配的CBM50 序列贡献最高, 分别为25.44%和17.6%。对于水解这两种结构多糖的CAZymes序列, δ-变形菌纲和γ-变形菌纲对其贡献在区域分布上呈相反趋势, 与它们在各自群落中百分比分布一致, δ-变形菌纲对CAZymes序列贡献呈现湾顶部(S11) > 中部(S5) > 湾口(S1)的变化趋势, 而γ-变形菌纲则正好相反。
图6 编码GH (23, 13, 3, 29, 109, 33, 16, 78)、CBM (40, 44, 48, 50)、CE1和PL22的基因序列在微生物群落中分布

Fig. 6 Contributions of the microbial communities to GH (23, 13, 3, 29, 109, 33, 16, and 78), CBM (40, 44, 48, and 50), CE1 and PL22 genes abundances

拟杆菌门和浮霉菌门是GH29 (岩藻聚糖糖苷酶)、GH33 (黏多糖水解酶, 催化唾液酸与糖蛋白之间糖苷键的水解)和CBM40 (GH33的辅助模块)、GH109 (氨基聚糖水解酶)和GH78 (鼠李糖苷酶)基因序列的主要贡献者。对于GH29和GH78家族而言, 拟杆菌门是其最大来源(图6), 主要由黄杆菌纲Flavobacteriia、拟杆菌纲Bacteroidia等组成; 其次是Kiritimatiellaeota门, 该门在此次调查尽管Cazymes种类多样性非常低, 然而对GH29和GH78序列的贡献占比分别为15.27%和13.47% (图6)。浮霉菌门对GH33、CBM40、GH29和GH109序列的贡献分别29.23%、33.98%、13.08%和21.48% (图6)。对GH109序列贡献较大的细菌其次为δ-变形菌门(12.24%, S11 > S5 > S1)、绿弯菌门(9.17%, S1 > S5 > S11)、拟杆菌(8.22%, S1 > S5 > S11)和γ-变形菌门(5.89%)。上述CAZymes是参与岩藻聚糖和几丁质或糖胺黏多糖等具有较强惰性且结构复杂的多糖降解, 因此, 大亚湾表层沉积物中拟杆菌门、浮霉菌门、γ-变形菌纲和酸杆菌门是降解结构较复杂多糖的主要贡献者(图6)。
对于涉及含β-葡聚糖或木聚糖的纤维素、半纤维素以及昆布多糖的水解酶, γ-变形菌纲的贡献最高, 如参与降解的β-葡聚糖CE1、GH16、GH3和CBM44在γ-变形菌纲分布远高于δ-变形菌纲, 贡献值分别为27.73%、35.62%、28.43%和17.03% (图6), γ-变形菌纲主要由着色菌目(Chromatiales)、纤维弧菌目(Cellvibrionales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)和海洋螺菌(Oceanospirillales)等组成。其次拟杆菌和δ-变形菌纲对GH16、GH3和CE1的也具有一定程度的贡献。特殊之处在交替单胞菌目下发现Mangrovitalea sediminis, 这表明大亚湾底层降解有机碳的微生物可能来源于周围红树林。对于丰度远高于其他多糖裂解酶的PL22, 酸杆菌门是寡聚半乳糖醛酸裂解酶PL22的主要贡献者(34.8%)(图6), 体现出其适应酸性有机底物的特性。
此次发现古菌对大部分CAZymes种类的贡献值基本都小于1%, 但以深古菌(Bathyarchaeota)为代表的古菌对CBM和CE中的优势种类贡献较为突出, 分别为CE1 (2.18%)(图6)、CBM40 (5.29%, 与GH33结合)(图6)和CBM44 (11.40%, 与GH16等纤维素或木聚糖水解酶结合)(图6)。对糖苷水解酶贡献较显著的为GH31 (2.83%)和GH33 (2.74%)(图6), 其他的糖苷水解酶类包含GH10、GH20、GH24、GH29、GH109、GH106、GH74和GH43等在内共计21种糖苷水解酶, 这些酶类功能主要包括对纤维素、半纤维素(木聚糖)和氨基糖(溶菌酶和几丁质降解产物)的水解。大亚湾表层沉积物病毒CAZymes序列反映了病毒侵染特性。一般而言, 噬菌体病毒侵染寄主首先吸附在寄主细胞壁上, 通过溶菌酶的作用在细菌的细胞壁上打开一个缺口然后进行“侵入”。因此表层沉积物中病毒CAZymes序列以编码溶菌酶(GH104、GH23、GH19、GH24和GH73)或神经氨酸酶GH33及其相关的CBM40为主。
从区域分布来看, 湾顶部S11样品中的δ-变形菌纲在群落组成中百分比最高, 而绿弯菌门在S11中百分比最低(图1), 这两个门包含的CAZymes序列同样呈现相似的分布规律, 如GH23和CBM50在δ-变形菌纲中的分布在S11最高(图6), 而针对编码β-葡聚糖降解的酶基因序列而言, 绿弯菌门则在S11中百分比最低(图6)。

3 讨论

与以往大亚湾沉积物调查相比, 本次调查总有机碳与以往研究结果含量水平相当, 而总氮与总磷含量都偏低(Wu et al, 2021)。氮磷含量的差异可能与季节、降雨量和人类活动影响有关。根据香港气象天文台数据, 2020年1—4月降雨量显著低于常年, 仅2020年4月降雨量比常年平均值低55% (https://www.hko.gov.hk/sc/index.html), 营养盐随地表径流输入量明显降低, 另外近年来的陆海统筹污染治理使大亚湾的富营养化程度有所改善, 这可能是调查期间沉积物氮磷含量显著低于历年水平的主要原因。大亚湾水体中的颗粒有机碳大部分(70%)为海洋自生有机物(牟新悦 等, 2017), 由于大亚湾水深较浅, 无大河流输入, 且与河口区域相比, 底质相对稳定, 水体中下沉的有机碎屑和生物残骸较易在沉积物中累积。
海洋沉积物中微生物群落组成与溶解氧和有机碳浓度密切相关, 除此之外还受水体深度、沉积物深度以及硫化物浓度等因子影响(Hoshino et al, 2020)。然而从代谢物动力水平来看, 对环境和相关群落的最新研究表明, 尽管物种群落中单个菌体或物种具有高度的可变性, 但在相似环境中的群落中, 通常观察到其基因或代谢途径是稳定的, 且对海洋和沉积物中基因丰度和营养水平关系的研究发现, 特定代谢基因的相对丰度比特定类群的丰度更能反映营养水平(Gowda et al, 2022)。本研究结合细菌CAZymes序列多样性, 按照功能和底物来区别分析, 发现CAZymes序列组成及其预测的功能反映了沉积物中微生物群落对有机碳代谢活动信息, 具有良好的指示意义。

3.1 CAZymes种类组成对碳水化合物代谢的指示意义

在全球领域(太平洋、大西洋和南大洋)海水中CAZymes大类序列组成比例基本稳定(Teeling et al, 2016; Zhao et al, 2020), 宏基因组数据中GHs、GTs、CBMs、AAs、CEs和PLs序列在总CAZymes序列丰度中平均百分比为24.9%、37.3%、9.3%、5.9%、18.2%和4.4%, 在宏基因组中Σ(GH+CBM+CE+PL)%的频率在0.4%~1.4%范围内伴随叶绿素波动变化, 该值在水华爆发和衰解阶段最高(Arnosti et al, 2021)。大亚湾沉积物中Σ(GH+CBM+CE+PL)在宏基因组中的频率为0.63%~0.68%与上述结果范围一致, 但大类组成上大亚湾沉积物中GTs和PLs偏低, 而CBMs所占比例高于以往报道的在水体中的比例。PLs偏低可能与水体中藻源酸性多糖含量高于沉积物相关。而CBM在沉积物中比例偏高与沉积物环境有关, 在沉积物中大分子碳水聚合物被沉积物颗粒和矿物所吸附, 会降低细菌对有机物的利用性(Arndt et al, 2013), 位于细菌膜上的CBM由于具有辅助不溶性多糖(肽聚糖、淀粉、纤维素、木聚糖等)与水解酶结合的功能(Guillén et al, 2010), 因此CBM在沉积物中比在水体中发挥更重要作用。本研究发现大亚湾沉积物中CBM在CAZymes序列丰度的占比(16.75%)明显高于大洋水体(太平洋、大西洋和南大洋)中的CBM/总CAZymes平均值(9.3%)(Teeling et al, 2016; Zhao et al, 2020)。该结果与Andrade等人(2017)对淡水湖CBM在水体和表层沉积物中差异分布结果一致, 反映了细菌在沉积物中对环境的适应性应答, 提高了细菌对沉积物中有机物的利用。例如高含量的CBM50促进了溶菌酶对细菌细胞壁肽聚糖的结合, 并且CBM50序列丰度随着沉积物深度而增加(Orsi et al, 2018)。
从家族丰度水平上来看, 常见的GH23、GH3、GH13等水解酶丰度与大西洋水体的分布结果相似(Teeling et al, 2016), 无论在水体和沉积物中, 三者都排在糖苷水解酶序列丰度前三位, 但岩藻聚糖水解酶GH29及其结合模块CBM47、鼠李糖水解酶GH78、结合模块CBM67以及降解氨基聚糖(如几丁质底物)的GH109序列丰度在大亚湾沉积物中都高于报道的水体中相对丰度, 例如编码GH29的序列相对丰度在大亚湾为229, 约是大西洋水体GH29相对丰度的2倍, 此结果与北美哥伦比亚河口和秘鲁边缘海沉积物宏基因组中富集GH29和GH78结果一致(Orsi et al, 2018; Smith et al, 2019)。另外大亚湾沉积物中降解海藻多糖(昆布多糖)的GH16和GH30等在沉积物的相对丰度比前期研究水体中偏低。GH29 (外切α-L-岩藻糖苷酶)、GH78 (鼠李糖苷酶)参与降解的藻类细胞壁、细菌胞外分泌物的硫酸化多糖, 主要存在于透明胞外聚合颗粒物(TEP)和海洋雪中, GH29和GH78序列在大亚湾沉积物中富集以及GH16序列偏低的丰度, 表明沉积物中累积大量上层水体沉降的TEP或藻类残骸, 而生物活性更强的昆布多糖等在水体中已有部分分解, 因此沉积物中的CAZymes组成与丰度主要受糖组分以及上层水体有机颗粒沉降的影响。含岩藻或鼠李糖结构的多糖因结构复杂负离子含量高、水溶性低而不易被降解, 因此在生物泵和海洋碳汇过程中发挥的重要作用(Vidal-Melgosa et al, 2021)。尽管大亚湾沉积物中富集了大量GH29和GH78序列, 但此次研究发现岩藻聚糖内切酶GH107的丰度远低于外切酶GH29, 且GH107仅在Kiritimatiellaeota和厚壁菌门(Firmicutes)中存在。内切酶(GH107)从主链内部断开糖苷键, 而外切酶(GH29)等从链末端裂解单体, 因此岩藻糖苷内切酶可以快速将长链切为多个小片段, 减少了岩藻聚糖溶于水体的时间, 使其更易被降解。Vidal-Melgosa等(2021)发现尽管大西洋海水中宏基因组数据中存在GH29, 但在宏蛋白组中的该酶表达率非常低, 这可能与宏蛋白组分析技术的缺陷或者采样阶段有关(Dong et al, 2014), 所以大亚湾沉积物中硫酸岩藻聚糖的是被微生物矿化再生还是被作为惰性碳埋藏, 需要更加深入的研究来证实。
大亚湾沉积物中编码多糖裂解酶(PLs)基因的相对丰度与Andrade等(2017)报道的淡水湖Caatinga Biome中PLs分布相似, 都以PL22序列占绝对优势, 然而Teeling等(2016)等报道, 大西洋水体藻华期间以编码裂解水华产生的海藻酸(甘露糖醛酸为主)的PL6、PL7和PL17序列为优势种类, 与本结果中PL22序列占据优势的特点具有显著组成差异。PL22裂解底物为寡聚半乳糖醛酸, 是裂解酶PL1裂解果胶的产物, 一般果胶主要来源于植物硅藻细胞壁或细菌胞外分泌物。以降解寡聚酸性糖PL序列占优势的特点表明大亚湾沉积物表层果胶质类的酸性多糖可能已经从长链结构酶解为低分子量的寡聚糖。同样, 根据AA家族中木质素降解酶的底物和功能来推断, 木质纤维素可能多为低分子量有机物形式存在。AA家族中丰度最高为AA6序列, 而AA6的底物为木质素的降解产物苯醌, AA6催化NADPH介导的对苯醌转化为对苯二酚(Mori et al, 2016), 转化过程中通过增加活性氧物种(Reactive Oxygen Species, ROS)水平来改造木质纤维结构, 氧化大分子木质素或多糖链的断裂, 使其溶解性增加, 增强了纤维素和半纤维素多糖与CAZymes的亲和性, 从而促进木质纤维降解(McGivern et al, 2021; Chirania et al, 2022)。AA6序列的大量存在(31.9%)指示了表层沉积物中陆源输入的木质素或木质纤维素可能已经有一定程度的断裂。另外AA家族除AA7之外都在S11的相对丰度最高, 体现了靠近红树林S11站底层沉积物中陆源木质素输入高于湾口。

3.2 CAZymes分布情况及其与环境因子的相关性

大亚湾沉积物中不同类别和不同来源的CAZymes基因, 受环境因素影响具有一定的分布差异。拟杆菌门、γ-变形杆菌纲和绿弯菌门编码的CAZymes基因大部分参与惰性较强的多糖(植物、藻类、细菌等残体)降解, 如编码岩藻聚糖水解酶(GH29和GH95)和鼠李糖水解酶(GH78), 编码参与降解酸性果胶质多糖(GH28、GH105和PL1)、昆布多糖(GH16和GH3)和纤维素或半纤维素(GH43和GH39)的基因序列, 上述CAZymes序列相对丰度在站位间上有一定的差异, 大多呈现湾口(S1) > 湾中部(S5) > 湾顶(S11)特征(图6), 这与春季大亚湾水体颗粒有机碳组成以及站位水体深度有关(Spearman正相关, r>0.9)。大亚湾水体中颗粒有机碳有高达70%属于海源自生有机物(牟新悦 等, 2017), 且湾口水深最大(19.5m)而湾顶部水深较浅(8.0m), 上层水体有机物向下沉降过程中, 水体中细菌优先利用活性强的碳水化合物, 经过选择性矿化, 保留在沉积物中偏惰性的糖类(如硅藻细胞壁成分)比例随水体深度变大而逐渐增加, 导致编码此类惰性糖类的CAZymes相对丰度增加。因此上层水体有机碳颗粒物沉降塑造了表层沉积物与有机碳降解相关的CAZymes基因序列的组成。另外GH23序列丰度在湾口高于湾顶的原因与沉降总量有关(Spearman正相关, r>0.9), 由于水较浅, 总有机碳的含量在S11最高, 因此GH23序列的相对丰度在S11站最高。以脱硫杆菌为主的δ-变形菌中编码碳水化合物合成的糖苷转移酶(GTs)与总有机碳和硫化物的含量呈正相关(Spearman相关, r>0.9), 表明受高浓度硫化物和有机碳驱动的脱硫杆菌代谢旺盛, 因此与细胞膜/壁和存储糖原合成相关的糖苷转移酶基因(GT4、GH2、GH81、GH9、GH30)丰度在S11站点高于S1和S5 (图7)。
图7 区域分布呈现差异的CAZymes酶种类热图

Fig. 7 Differences of the relative abundance between the samples

本次调查的CAZymes的香浓指数位于2.4~3.9之间, 低于人类肠道微生物的CAZymes香浓指数水平(Smits et al, 2017), 与海洋沉积物中真菌CAZymes香浓指数水平(3.0~4.0)接近(Baltar et al, 2021)。浮霉菌门、拟杆菌门和γ-变形菌纲的CAZymes香浓指数最高, 验证了这几种类群具有强大的降解复杂结构多糖的能力。浮霉菌作为一种适宜寡营养环境中生长缓慢的细菌, 已有试验研究发现在以N-乙酰氨基葡萄糖或者细菌胞外分泌物为唯一营养物培养基中进行长期筛选培养, 浮霉菌表现出生长优势, 并且GH109丰度是仅次于GH23家族的第二大家族(Dedysh, 2011; Wang et al, 2015; Costa et al, 2020)。因此大亚湾沉积物中浮霉菌对GH109的贡献, 与沉积物中高TOC : TN值所反映的沉积物处于较低营养水平的结论相一致。同样在群落组成上与此相对应的是, 此次调查期间没有发现在广布且偏向利用活性有机氮的Woeseiaceae科(γ-变形菌纲)(Hoffmann et al, 2020), 因此活性有机氮可能被迅速消耗利用, 而惰性强的多糖被保留在沉积物中。
降解硫酸化岩藻多糖是拟杆菌门、γ-变形菌纲、Kiritimatiellaeota和浮霉菌门的共同特征, 它们更适应缺氧环境(van Vliet et al, 2019; Boey et al, 2021)。Kiritimatiellaeota以前分类上归属疣菌门(Verrucomicrobia)第5分支, 后独立划为Kiritimatiellaeota门, 两者成员之间的进化差异反映在不同的栖息地偏好(Spring et al, 2016)。大多数疣菌门的1、2、3、4和6分区门栖息在土壤、淡水或海洋环境中, 新陈代谢适应有氧或微需氧条件, 相反Kiritimatiellaeota门的成员占据主要是以缺氧条件为特征的生态位。根据在本研究中发现大亚湾沉积物中Kiritimatiellaeota富集岩藻外切糖苷酶GH29、GH95和岩藻聚糖内切酶GH107, 而常见的降解硫酸岩藻聚糖的疣菌门在调查期间对GH29的贡献非常低, 表明调查期间大亚湾表层沉积物中溶解氧可能是驱动群落对复杂碳水化合物利用的环境因子之一。
古菌是沉积物中有机物的降解者之一(Lloyd et al, 2013; Meng et al, 2014; Lazar et al, 2016), 例如Bathyarchaeota可以利用蛋白质、脂类以及植物来源的纤维和木质素等(Yu et al, 2018)。然而大亚湾沉积物表层细菌对CAZymes序列贡献占99%, 而古菌、病毒和真菌的贡献非常低。同样, 在秘鲁边缘海细菌对沉积物CAZymes的贡献高达90%~99%, 且随沉积物深度增加呈线性下降趋势, 而古菌呈相反特征。反映了表层沉积物因“新鲜”有机物不断输入导致细菌酶水解速率最高, 但在长时间尺度成岩作用下惰性有机物的比例随着沉积深度而增加, 导致在深层厌氧区古菌对CAZymes贡献增加(Orsi et al, 2018)。尽管古菌对大亚湾表层沉积物大部分CAZymes种类的贡献基本都小于1%, 但本次调查发现表层古菌对CBM、GT和CE中的几种优势的CAZymes贡献较为突出, 特别是与纤维素或半纤维素降解相关的CE1和CBM44, 表明大亚湾沉积物表层古菌在纤维素和半纤维素利用上具有一定优势。另外大亚湾沉积物中真菌对CAZymes贡献低的现象, 可能与调查期间干旱导致的陆源有机物和氮盐以及铁输入降低有关(Taylor et al, 2016; Baltar et al, 2021)。

4 结论

2020年春季大亚湾表层沉积物中, 浮霉菌门、拟杆菌门和γ-变形菌纲CAZymes家族的生态多样性最高, 是降解结构复杂多糖的优势种群, 酸杆菌是寡聚半乳糖醛酸裂解优势菌群, δ-变形菌纲是编码降解肽聚糖和几丁质相关的CAZymes最大贡献者。古菌除编码降解纤维素、半纤维素和氨基糖的个别酶类较为突出(贡献值介于2.18%~11.1%)外, 对大部分CAZymes贡献值都低于1%。CAZymes的底物主要源自于湾内自生的有机碎屑, 编码降解藻源有机碎屑CAZymes序列的相对丰度湾口高于湾东北部。编码降解木质素相关辅助酶类序列的相对丰度在邻近红树林的东北部海区最高, 其促进了木质素、纤维素等大分子碳水化合物断裂, 增加了糖苷水解酶与惰性难降解大分子碳水化合物的亲和性。大亚湾表层沉积物中微生物及其CAZymes基因的区域分布主要与上层水体有机颗粒沉降以及水深相关。本研究在细菌CAZymes基因多样性分析的基础上, 结合功能和底物来区别研究, 发现CAZymes基因组成可有效表征沉积物中微生物群落对大分子碳水化合物降解的有关活动信息, 对进一步厘清近海沉积物中复杂的碳循环过程具有一定参考意义。
表S1 CAZymes 主要功能列表

Tab. S1 The major activity of CAZymes

序号 CAZymes 名称或主要功能
1 GH3 β-葡萄糖苷酶/β-N-乙酰基己糖胺酶
2 GH4 α-半乳糖醛酸酶/麦芽糖-6-磷酸葡萄糖苷酶/6-磷酸-β-葡萄糖苷
3 GH5 内葡聚糖酶
4 GH13 异淀粉酶/1,4-α-葡聚糖分支酶/α-葡萄糖苷酶/α淀粉酶
5 GH15 葡聚糖酶/α-海藻糖酶/糖化酶
6 GH16 内切-1,3-β-葡聚糖酶
7 GH17 内切-1,3-β-葡萄糖苷酶
8 GH18 几丁质酶
9 GH20 己糖胺酶
10 GH23 溶菌酶/可溶性溶菌素转糖基酶/膜结合溶菌素转糖基酶
11 GH29 α-L-岩藻糖苷酶
12 GH30 β-葡萄糖苷酶/葡糖基神经酰胺酶/β-葡萄糖醛酸酶/内切-β-1,6-半乳糖苷酶
13 GH31 α-D-木糖苷木糖水解酶/α-葡萄糖苷酶/寡糖4-α-D-葡萄糖基转移酶
14 GH32 果聚糖内切酶
15 GH33 唾液酸酶或神经氨酸酶/反式唾液酸酶/脱水唾液酸酶/2-酮-3-脱氧壬酸水解酶
16 GH43 木聚糖1,4-β-木糖苷酶
17 GH57 1,4-α-葡聚糖分支酶
18 GH65 麦芽糖磷酸化酶/海藻糖磷酸化
19 GH73 溶菌酶
20 GH77 4-α-葡聚糖转移酶
21 GH78 α-L-氨苷酶
22 GH95 α-L-岩藻糖苷酶2
23 GH102 肽聚糖裂解转糖苷酶
24 GH103 肽聚糖裂解转糖苷酶
25 GH105 不饱和鼠李糖乳糖酰水解酶
26 GH106 α-L-鼠李糖苷酶
27 GH108 N-乙酰胞壁质酶
28 GH109 N-乙酰氨基己糖苷酶
29 GH127 β-L-阿拉伯糖苷酶
30 GH130 β-1,2-甘露糖磷酸化酶
31 GH145 L-鼠李糖-α-1,4-D-葡萄糖醛酸裂解酶
32 GH149 β-1,3-葡聚糖磷酸化酶
33 CE1 乙酰木聚糖酯酶/S-甲酰谷胱甘肽水解酶/聚羟基丁酸解聚酶/ /羧酸酯酶
34 CE2 乙酰木聚糖酯酶
35 CE3 乙酰木聚糖酯酶
36 CE4 乙酰木聚糖酯酶/甲壳素脱乙酰酶/壳寡糖脱乙酰酶肽聚糖脱乙酰酶/肽聚糖 N-乙酰胞壁酸脱乙酰酶
37 CE6 乙酰木聚糖酯酶
38 CE7 乙酰木聚糖酯酶
39 CE8 果胶酯酶
40 CE9 N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶/N-乙酰氨基半乳糖6-磷酸脱乙酰酶
41 CE10 芳香酯酶/羧基酯酶等
42 CE11 尿苷二磷酸-3-O-[3-羟基肉豆蔻酰基]N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶/尿苷二磷酸-3-O-[3-羟基肉豆蔻酰]N-乙酰基葡萄糖胺脱乙酰酶/3-羟基酰基-[酰基载体蛋白]脱水酶
43 CE12 果胶乙酰酯酶
44 CE13 果胶乙酰酯酶
45 CE14 二乙酰基壳二糖去乙酰化酶
46 CE15 4-O-甲基葡萄糖醛酸甲酯酶
47 CE16 乙酰酯酶
48 AA2 过氧化氢酶过氧化物酶
49 AA3 葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族/胆碱脱氢酶
50 AA4 乙醇酸氧化酶/D-乳酸脱氢酶(细胞色素)
51 AA6 醌还原酶
52 AA7 葡萄糖氧化酶/壳寡糖氧化酶/纤维低聚糖脱氢酶
53 AA9 依赖铜的裂解多糖单加氧酶
54 AA12 吡咯喹啉醌依赖性氧化还原酶
55 AA13 依赖铜的裂解多糖单加氧酶
56 PL1 果胶裂解酶
57 PL2 果胶裂解酶
58 PL4 鼠李糖半乳糖醛酸内切酶
59 PL5 海藻酸裂解酶
60 PL6 海藻酸裂解酶
61 PL7 海藻酸裂解酶
62 PL8 软骨素裂解酶
63 PL9 果胶裂解酶
64 PL10 果胶裂解酶
65 PL12 硫酸肝素裂解酶
66 PL14 聚(β-甘露糖醛酸)裂解酶/M-特异性海藻酸裂解酶
67 PL15 海藻酸裂解酶/肝素裂解酶/肝素裂解酶 I/肝素-硫酸盐裂解酶/肝素裂解酶 Ⅲ
68 PL17 海藻酸裂解酶
69 PL18 海藻酸裂解酶
70 PL21 肝素裂解酶/肝素-硫酸盐裂解酶/阿查兰-硫酸盐裂解酶
71 PL22 低聚半乳糖醛酸裂解酶
72 PL24 石莼多糖裂解酶
73 CBM6 结合纤维素、β-1,4-木聚糖、β-1,13-葡聚糖、β-1, 3-1,4-葡聚糖和β-1,3-葡聚糖
74 CBM9 结合纤维素
75 CBM11 与β-1,4-葡聚糖和β-1,3-1,4-混合连接葡聚糖结合
76 CBM16 结合纤维素和葡甘聚糖
77 CBM13 与纤维素结合
78 CBM20 与淀粉结合
79 CBM23 与甘露聚糖结合
80 CBM32 结合半乳糖、乳糖和N-乙酰-D-乳糖胺
81 CBM37 与木聚糖、几丁质、显微晶质和磷酸纤维素结合
82 CBM40 与GH33结合
83 CBM41 与α-葡聚糖-直链淀粉、支链淀粉、普鲁兰聚糖结合
84 CBM44 结合纤维素和木聚糖
85 CBM47 与岩藻糖结合
86 CBM48 附加到GH13模块
87 CBM50 附着于GH18、GH19、GH23、GH24、GH25和GH73家族的各种酶, 即裂解甲壳素或肽聚糖的酶
88 CBM57 附着于各种糖苷酶
89 CBM66 与果聚糖的果糖苷末端结合, 辅助β-果糖苷外切酶
90 CBM67 与L-鼠李糖结合
91 GT2 纤维素、几丁质、葡聚糖、甘露聚糖、透明质酸合成酶/N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶等
92 GT4 蔗糖合成酶/蔗糖-磷酸合成酶/α-葡萄糖基转移酶/脂多糖N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶等
93 GT9 脂多糖-乙酰氨基葡萄糖转移酶
94 GT26 β-N-乙酰甘露糖苷酰转移酶/β-1,4-葡萄糖基转移酶β-1,4-半乳糖基转移酶
95 GT28 1,2-二酰甘油3-β-半乳糖基转移酶; 1,2-二酰甘油3-β-葡萄糖基转移酶/β-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶/双半乳糖基二酰甘油合成酶
96 GT30 α-3-脱氧-D-甘露聚糖-辛酸转移酶
97 GT35 糖原或淀粉磷酸化酶
98 GT39 蛋白α-甘露糖基转移酶
99 GT51 胞壁质聚合酶
100 GT81 葡萄糖基-3-磷酸甘油酸合成酶/甘露糖基 -3-磷酸甘油酸合成酶/ 葡萄糖基-2-甘油酸合成酶/甘露糖基-3-磷酸甘油酸合成酶/3-磷酸甘油酸α-甘露糖基转移酶
101 GT83 4-氨基-4-脱氧-β-L-阿拉伯糖基转移酶/半乳糖醛酸基转移酶

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