Orginal Article

Verification of QTL and genotype selection effect of QTL for growth-related traits in the Pearl Oyster, Pinctada fucata

  • WEI Guojian , 1, 2, 3 ,
  • LI Yaoguo 1, 2, 3 ,
  • LIN Jianshi 1, 2 ,
  • HE Maoxian , 1, 2
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  • 1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
  • 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
Corresponding author: HE Maoxian. E-mail:

Received date: 2016-07-28

  Request revised date: 2016-09-12

  Online published: 2017-04-06

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Marine Fishery Science and Technology Development Project in Guangdong Province (Z2014014, Z2015014)

Science and Technology Plan Project of Guangdong Province (2014B030301064)

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热带海洋学报编辑部

Abstract

QTL411871 was identified in the verifying population of Pinctada fucata, and two genotype matings♀AT×♂AT(Group No.30 ) and ♀TT×♂AT(Group No.31) were established to analyze genotype selection effect of QTL. The results showed that QTL411871 was significantly associated with muscle mass in the verifying population (P<0.05), and AT was the superior genotype. QTL411871 was not significantly associated with growth traits in Groups No. 30 and No. 31 (P>0.05); the genetic effect of AT genotype was small, but it was still the genotype with the maximal average of growth traits. QTL423886 was significantly associated with shell height, shell length and total weight in Group No. 30 (P<0.05), and the oysters with genotype AG were bigger than those with the genotype GG in terms of shell height, shell length and total weight, but it was not significantly associated with growth traits in Group No.31 (P>0.05). Diplotypes were constructed based on the two QTLs, and association analyses revealed that C1 (ATAG) in Group No.30 and D1 (ATAA) in Group No.31 might be the most advantageous diplotypes for growth traits. These results are useful for developing molecular marker assisted breeding of Pinctada fucata.

Cite this article

WEI Guojian , LI Yaoguo , LIN Jianshi , HE Maoxian . Verification of QTL and genotype selection effect of QTL for growth-related traits in the Pearl Oyster, Pinctada fucata[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2017 , 36(2) : 19 -25 . DOI: 10.11978/2016072

分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection, MAS)是通过与目标性状紧密连锁的分子标记进行选择从而达到对目标性状进行选择的目的, 即实现基因型选择育种。与传统的育种方法相比, 它可以大大提高选择的效率和可靠性(Ozaki et al, 2012), 因此已成为目前水产养殖动物遗传育种研究的热点和重点。
实施MAS技术首先要获得与目标性状显著关联的分子标记。随着测序技术的发展, 遗传连锁图谱构建、数量性状位点(QTL)定位以及性状关联分析在水产养殖动物取得了较大的进展, 但是利用QTL连锁标记实现基因型选择的研究还较少, 其主要原因是很少对QTL定位结果作进一步的验证和鉴定, 其真实的遗传效应还不清楚, 因而限制了其应用。
对QTL定位结果进行验证是实施MAS技术的重要前提(Romagosa et al, 1999)。QTL验证的最简单方法是比较QTL不同等位基因的表型差异, 更进一步的验证是用另外的分离群体检测QTL的遗传效应(Romagosa et al, 1999; Yue, 2014 )。目前, 仅在牙鲆Paralichthys olivaceus(Fuji et al, 2007; Wang et al, 2014)、大西洋鲑鱼Salmo salar(Moen et al, 2009; Tsai et al, 2015)、虹鳟Oncorhynchus mykiss (Wringe et al, 2010; Baerwald et al, 2011; Vallejo et al, 2014)、尖吻鲈Lates calcarifer(Wang et al, 2008)、鲤鱼Cyprinus carpio(鲁翠云 等, 2012)等少数鱼类的抗病和生长QTL进行了验证, 并且已有少数QTL定位结果成功应用于MAS育种实践中(Fuji et al, 2007; Chen et al, 2008; Moen et al, 2009; 鲁翠云 等, 2012 )。
在海洋贝类中, 还极少见有对QTL定位结果进行鉴定和应用的报道。马氏珠母贝Pinctada fucata是世界上重要的海水珍珠生产贝类, 具有极高的经济价值。与大多数水产养殖动物一样, 目前马氏珠母贝的育种方法主要还是基于表型的传统选择, 为了提高其育种效率, 有必要开展基因型选择育种研究。最近, Shi等(2014)利用2b-RAD测序技术获得3117个SNP标记, 构建了其高密度遗传图谱, 并定位到6个与壳长、铰合线长、总重、珍珠层厚度相关的QTL。Li等(2014)利用RAD测序技术构建高密度遗传连锁图谱, 定位到与7个生长性状相关的QTL。目前, 仅有少数QTL标记被鉴定(韦国建 等, 2015)。
本研究以遗传作图获得QTL411871为基础(Li et al, 2014), 在验证群体中对其进行初步验证, 然后对亲本的基因型进行鉴定, 建立两种基因型组配, 分析QTL411871的实际遗传效应以及与QTL423886之间的相互作用, 为深入开展马氏珠母贝MAS育种技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验群体

用于QTL411871验证的群体为马氏珠母贝“南科1号”育种群体第三代(G3, n=106), 基因型组配的亲本为“南科1号”育种群体第四代(G4, n=211), 养殖于深圳大鹏澳海区, 2贝龄。用游标卡尺测量G3群体每只贝的壳高、壳长、壳宽和铰合线, 精确到0.01mm; 用电子天平称量总重、壳重、软体部重和闭壳肌重, 精确到0.01g, 分别取每只贝的闭壳肌组织置于90%乙醇, 于-20℃保存。G4群体的亲本基因型鉴定为活体鉴定, 即从活体的贝中取下一小块的鳃组织进行固定, 将其进行编号继续进行养殖作为基因型组配的亲本。

1.2 基因组DNA的提取及基因分型

使用Hipure Universal DNA Kit提取鳃/闭壳肌组织的基因组DNA, 相关操作参照试剂盒说明书。提取DNA后, 于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性; 并用分光光度计检测其纯度及浓度。提取的DNA于-20℃保存。
以QTL411871的序列在已公布的马氏珠母贝基因组草图(http://marinegenomics.oist.jp/)进行 Blast 比对, 找出与之匹配的序列。根据匹配的序列和 QTL 标记 SNP 位置, 利用 Tetra-primer ARMS 在线引物设计程序(http://primer1.soton.ac.uk/primer1.html)设计引物(表1)。采用ARMS-PCR方法对G3和G4群体中QTL411871基因型进行鉴定。25µL 的 PCR 反应体系为: 2.5µL10×PCR 缓冲液, 2µL dNTP 混合液(各2.5mmol·L-1), 0.25µLTaq DNA 聚合酶 (5U·µL-1), 内引物FI、RI 各2µL (10µmol·L-1), 外引物FO、RO各0.5µL (10 µmol·L-1), 0.5µLDNA(100ng·µL-1), 14.75µL ddH2O。PCR程序为: 94℃预变性 4min; 94℃变性30s, 56℃退火30s, 72℃延伸30s, 30个循环; 最后72℃延伸 5min。PCR 反应产物用3%的琼脂糖凝胶电泳检测。
Tab. 1 Primers used for analysis of QTL411871

表1 QTL411871标记SNP分型引物

引物
名称
序列(5'-3') 退火
温度/℃
等位基因 对应产物/bp
FI GGAAACGGAATTCACATTCATTATCTTTA 64 A 200
RI AATGTCAAGCTGGATATAATTTAGCTCTA 60 T 171
FO AAATTATTGAAACTATTTCACCGATTCG 62 空白 空白
RO TTGTGATTTCATTTTCGTATCAATATTCTT 62 空白 空白

1.3 基因型组配

根据亲本QTL411817标记基因分型结果建立2组基因型组配方式: ♀AT×♂AT(30号组配); ♀TT×♂AT(31号组配), 各个组配为单对配对, 于2015年5月在深圳大鹏澳海区进行人工授精, 在相同的条件下进行繁育、养殖和管理。从 30号和31号组配子代中随机抽样, 每组190只(5月龄贝), 测量每只贝的壳高、壳长、壳宽和铰合线, 称量总重、壳重和软体部重, 并分别取闭壳肌组织置于90%乙醇, 于-20℃保存。利用飞行时间质谱法(MALDI-TOF- MS)对组配子代中的QTL411871和423886标记(Li and He, 2014)进行基因型鉴定, 分型鉴定由北京华诺时代科技有限公司完成。

1.4 数据统计与分析

利用PIC_CALC软件计算QTL标记的多态信息含量(polymorphism content information, PIC)。利用PopGene 32.0软件计算QTL在群体中期望杂合度(expected heterozygosity, He)和观测杂合度(observed heterozygosity, Ho), 并进行哈迪-温伯格平衡(Hardy- Weinberg equilibrium, HWE)的检验。利用SPSS19.0软件中的一般线性模型(GLM)进行标记与生长性状的相关性分析, 模型如下:
Yij=u+Gi (Di)+eij
其中Yij表示基因型为i的第j个个体的指标, u表示群体均值, Gi表示第i种基因型的效应, Di表示第i种二倍型的效应, eij表示随机误差变量; 基因型对应性状均值之间的差异用Duancan法进行多重比较分析, 显著性差异设为P<0.05。计算优势基因型效应: 优势基因型效应=(优势基因型的性状均值-各基因型性状均值)/各基因型性状均值×100%(Romagosa et al, 1999)。

2 结果

2.1 QTL标记的遗传参数分析

将获得的QTL411871和423886标记的基因分型数据, 用PIC_CALC软件和Popgene32.0软件进行处理, 遗传参数见表2所示。这2个QTL标记在实验群体中PIC均在0.25~0.50之间, 表现为中度多态性。QTL411871在G3群体中HoHe分别为0.4688和0.4973, 符合哈迪-温伯格平衡; QTL411871和423886标记在30号组配中HoHe分布区间分别为0.5081~0.5243和0.5002~0.3879, 在31号组配中HoHe分布区间分别为0.4947~0.5291和0.3733~ 0.4703。通过哈迪-温伯格平衡(HWE)检验, 结果表明QTL423886标记在30号组配中以及QTL411871标记在31号组配中显著偏离哈迪-温伯格平衡。
Tab. 2 Genetic parameters of QTLs in P. fucata

表2 QTL标记的遗传参数

群体/组配 QTL PIC Ho He HWE P
G3群体 411871 0.3737 0.4688 0.4973 0.5388
30号组配 411871 0.3744 0.5081 0.5002 0.8286
31号组配 411871 0.3031 0.4947 0.3733 0.0000*
30号组配 423886 0.3121 0.5243 0.3879 0.0000*
31号组配 423886 0.3591 0.5291 0.4703 0.0848

注: *表示经过校正后仍显著偏离哈迪-温伯格平衡的位点。

2.2 QTL411871的验证

QTL411871标记在G3群体中检测到3种基因型。经SPSS19.0软件的GLM模型分析, QTL411871标记与闭壳肌重显著相关(P<0.05)(表3), 多重比较发现, AA 和 AT 基因型个体的壳长、铰合线、软体部重和闭壳肌重显著大于 TT 基因型, AA 和 AT 基因型的生长性状值没有显著性差异, 且 AT 基因型的生长性状值最大, AT 为优势基因型(表4)。
Tab. 3 Association analysis of QTL411871 and growth traits in P. fucata using GLM

表3 马氏珠母贝 QTL 411871与G3群体生长性状的 GLM 分析

因变量 平方和 自由度 均方 均方比 显著性水平
壳高 131.931 2 65.965 1.646 0.198
壳长 190.819 2 95.409 2.662 0.075
壳宽 102.914 2 51.457 2.621 0.078
铰合线 13.046 2 6.523 1.751 0.179
总重 101.711 2 50.856 1.796 0.172
壳重 14.224 2 7.112 0.837 0.436
软体部重 23.358 2 11.679 2.905 0.060
闭壳肌重 1.138 2 0.569 3.853 0.032
Tab. 4 Multiple comparison of growth traits in P. fucata G3 population at QTL411871 loci

表4 QTL411871不同基因型与G3群体生长性状的多重比较

基因型 数量 壳高/mm 壳长/mm 壳宽/mm 铰合线/mm 总重/g 壳重/g 软体部重/g 闭壳肌重/g
AT 45 49.09±6.13a 47.80±6.04a 17.36±1.88a 41.22±4.77a 17.64±5.14a 9.97±2.61a 5.47±2.06a 0.92±0.41a
AA 29 48.93±7.06a 46.78±6.48a 17.70±2.05a 40.74±4.34a 17.60±5.92a 9.85±3.09a 5.44±2.19a 0.84±0.42a
TT 22 46.24±5.68a 44.21±5.12b 16.69±1.87a 38.61±3.76b 15.17±4.81a 9.01±3.27b 4.28±1.59b 0.64±0.31b

注: 同一列上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05), 下同。

2.3 QTL的基因型选择效应

根据飞行时间质谱法获得的基因型进行统计, 利用SPSS19.0软件的GLM模型进行QTL411871标记与生长性状的相关性。结果表明, 在30号和31号组配中, QTL411871标记与生长性状关联不显著(P>0.05)。但经过基因型多重比较发现, 组配中AT基因型个体的生长性状均值仍是最大的(表5), 这与初步验证的结果一致。QTL411871标记AT基因型在30号组配中壳高、壳长、壳宽、铰合线、总重、软体部重和壳重的遗传效应分别为0.85%、0.94%、0.74%、0.79%、3.43%、2.46%和2.02%; 在31号组配中AT基因型壳高、壳长、壳宽、铰合线、总重、软体部重和壳重的遗传效应分别为1.17%、0.67%、0.76%、0.81%、2.14%、5.26%和1.17%。结果表明QTL411871标记优势基因型AT组配后的遗传效应较小。
Tab. 5 Multiple comparison of growth traits in P. fucata at QTLs loci

表5 QTL标记不同基因型在2个组配中的生长性状值的多重比较

组配 QTL 基因型 数量 壳高/mm 壳长/mm 壳宽/mm 铰合线/mm 总重/g 软体部重/g 壳重/g
30号 411871 AT 94 29.66±4.11a 33.14±3.95a 10.94±3.63a 30.50±3.63a 3.92±1.62a 1.25±0.60a 2.02±0.78a
TT 41 29.23±3.20a 32.60±2.85a 10.92±1.26a 30.29±3.15a 3.76±1.18a 1.22±0.42a 1.95±0.53a
AA 50 29.07±3.70a 32.44±3.43a 10.67±1.40a 29.77±3.19a 3.59±1.21a 1.16±0.46a 1.92±0.63a
423886 AG 97 30.39±4.10a 33.55±3.96a 11.03±1.69a 30.47±3.76a 4.06±1.67a 1.31±0.66a 2.08±0.80a
GG 88 28.69±3.13b 32.45±2.94b 10.80±1.20a 30.04±2.90a 3.64±1.06b 1.17±0.35a 1.93±0.53a
31号 411871 AT 94 34.71±3.89a 37.40±3.41a 13.21±1.59a 33.80±3.82a 5.73±1.78a 2.00±0.75a 2.87±0.83a
TT 96 33.92±3.62a 36.91±3.60a 13.01±1.69a 33.26±3.59a 5.49±1.65a 1.81±0.64a 2.78±0.78a
423886 AA 68 34.55±4.09a 37.33±3.79a 13.10±1.67a 33.65±3.73a 5.60±1.85a 1.94±0.78a 2.85±0.85a
AG 100 34.43±3.53a 37.29±3.41a 13.11±1.62a 33.62±3.84a 5.72±1.68a 1.91±0.67a 2.85±0.80a
GG 21 33.10±3.71a 35.96±2.96a 12.85±1.69a 32.70±3.07a 5.11±1.47a 1.74±0.57a 2.59±0.67a

注: 同一列上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

在30和31号组配中, 对另一个标记QTL423886进行基因型鉴定, 并对其与生长性状进行关联分析。结果表明, QTL423886标记在30号组配中与壳高、壳长和总重显著相关(P<0.05), AG基因型个体的壳高、壳长和总重均值显著高于GG基因型, AG基因型在壳高、壳长和壳宽的基因型效应分别为2.88%、1.67%和5.45%; 而在31号组配中与生长性状关联不显著(P>0.05) (表5)。

2.4 QTL411871和423886标记SNP二倍型构建与生长性状的关联分析

为了进一步研究QTL411871和423886标记SNP对生长性状的作用。基于这2个QTL标记在这2个组配中分别构建二倍型。经过SPSS19.0软件的GLM分析发现, 这2个QTL标记在30号组配中与壳高存在交互作用(P<0.05), 通过基因型多重比较,发现二倍型C1(ATAG)在壳高、壳长、总重、软体部重和壳重显著大于C6(TTGG)型; 而在31号组配中与生长性状不存在交互作用(P>0.05), 但不同基因型在生长性状上差异显著, 通过基因型多重比较, 二倍型D1(ATAA)在壳高、壳长、铰合线、总重、软体部重和壳重显著大于D6(TTGG)型(表6), 可作为优选的基因型组合。
Tab. 6 Multiple comparison of growth traits among diplotypes of QTL in P. fucata

表6 QTL标记SNP二倍型生长性状的多重比较

组配 二倍型 QTL
411871
QTL
423886
数量 壳高/mm 壳长/mm 壳宽/mm 铰合线/mm 总重/g 软体部重/g 壳重/g
30号 C1 AT AG 52 30.70±4.33a 33.88±4.17a 11.25±1.90a 30.77±3.90a 4.28±1.88a 1.41±0.76a 2.20±0.92a
C2 AA AG 25 33.42±3.78ab 33.42±3.27ab 10.87±1.21a 30.21±3.16a 3.83±1.28ab 1.19±0.46ab 1.93±0.59ab
C3 TT AG 19 30.07±3.58ab 33.88±4.17ab 11.82±1.55a 30.29±4.06a 3.88±1.45ab 1.20±0.54ab 2.00±0.96ab
C4 AA GG 24 29.26±3.36ab 33.00±2.70ab 10.97±1.24a 30.87±2.75a 3.90±1.03ab 1.29±0.38ab 2.07±0.51ab
C5 AT GG 42 28.60±2.96b 32.34±2.93b 10.76±1.14a 30.31±2.97a 3.55±0.99b 1.10±0.33b 1.90±0.52b
C6 TT GG 21 28.36±3.26b 32.11±3.30b 10.97±1.29a 30.11±3.06a 3.57±1.22b 1.18±0.35b 1.86±0.56b
31号 D1 AT AA 36 35.38±4.44a 37.89±4.04a 13.26±1.73a 34.57±3.76a 5.89±2.08a 2.11±0.88a 2.97±0.97a
D2 AT AG 44 34.49±3.32ab 37.26±2.99ab 13.17±1.43a 33.41±4.05ab 5.67±1.61ab 1.93±0.69ab 2.82±0.76ab
D3 TT AG 56 34.39±3.72ab 37.32±3.73ab 13.16±1.77a 33.78±3.70ab 5.77±1.74ab 1.90±0.66ab 2.87±0.84ab
D4 AT GG 14 33.67±4.00ab 36.56±2.90ab 13.23±1.78a 33.03±3.04ab 5.50±1.52ab 1.93±0.57ab 2.74±0.71ab
D5 TT AA 32 33.62±3.60ab 36.70±3.57ab 12.93±1.64a 32.62±3.51b 5.27±1.54ab 1.74±0.63b 2.72±0.70ab
D6 TT GG 7 31.98±3.03b 34.75±2.90b 12.08±1.30a 32.03±3.25b 4.32±1.07b 1.36±0.34b 2.29±0.52b

注: 同一列上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 讨论

Andrew(2010)认为, 当处于HWE状态的各个等位基因, 其在群体中的分布频率应是稳定的, 杂合度之间没有显著性的差异。本研究中30号组配的QTL423886标记以及31号组配的QTL411871标记被检测到的平均观测杂合度和期望杂合度差异很大, 说明QTL423886标记在30号组配及QTL411871标记在31号组配中没有处于HWE状态, 卡方检验也体现了这一点。分析原因主要是由于人工选择和非随机交配等因素导致的(Waples, 2015)。
尽管国内外在水产养殖动物遗传作图、QTL定位以及性状关联分析方面取得了较大进展, 但是将QTL结果应用到指导育种的研究却很少, 比较成功的例子是牙鲆抗淋巴囊肿病(LD)(Fuji et al, 2007)、大西洋鲑鱼抗传染性胰脏坏死症(IPN)(Moen et al, 2009)和半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis 的早期性别鉴定(Chen et al, 2008)等。如何验证这些定位到的QTL标记与性状的相关性, 进而利用与性状紧密连锁的QTL标记进行性状的遗传改良, 将是遗传育种下一阶段的研究重点。
在虹鳟中, 以OmyRGT41TUF的130bp等位基因作为抗传染性胰脏坏死症的选择标记构建的家系中, 4个杂合家系的平均累计死亡率(58.7%)远低于6个纯合家系(80.7%), 表明杂合个体的抗病力强于纯合个体(孙效文, 2010)。本研究以遗传作图获得的QTL411871连锁分子标记为基础, 在验证群体中进行初步验证, 建立不同基因型组配产生的分离群体, 进一步验证QTL411871的实际遗传效应, 发现在验证群体中QTL411871与闭壳肌重显著相关, 优势基因型为AT。建立不同的基因型组配, 在30和31号组配中与生长性状关联不显著, QTL411871的优势基因型AT遗传效应较小, 但其AT基因型个体的生长性状均值仍是最大的, 预测其还是存在一定的选择利用价值。
研究表明, 同一标记位点在不同发育阶段的表现不完全一致。例如筛选建鲤 (Cyprinus carpio var. Jian) ODC1基因上增重相关SNP时就出现类似不同发育阶段的差异与基因表达水平相一致的现象(李红霞 等, 2014)。标记-性状的关联可能是由于标记位点与QTL间的配子相连锁不平衡造成的, 也可能是由于标记位点间本身对性状具有多效性, 而由连锁所造成的关联将随时间而变化(王辉, 2001)。这些都会使其遗传效应发生变化。人工定向选择对各个基因型的频率也有不同程度的影响(Sun et al, 2010)。这些原因都会使其QTL遗传效应发生变化。
单独的SNP位点进行性状的关联分析提供的信息往往是有限的, 通过2个或2个以上的SNP位点基因型组合可以提供丰富的遗传信息来弥补单独SNP的缺陷(Tabor et al, 2002; de Bakker et al, 2005; He et al, 2012)。García-Magariños等(2009)发现人类一些复杂疾病可能与 SNP-SNP 相互作用有关。在本研究中, 基于QTL411871和423886标记分别在30号组配和31号组配中构建二倍型, 并与生长性状进行关联分析, 结果表明, 二倍型C1(ATAG)在30号组配中及D1(ATAA)在31号组配中对马氏珠母贝的生长最为有利, 可作为优选的基因型组合。这两种优选的组合方式中都包含了这2个QTL的优势基因型, 即可能存在优势基因型的聚合效应, 但还需后续的实验来进行验证。

The authors have declared that no competing interests exist.

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