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Journal of Tropical Oceanography >

2017 , Vol. 36 >Issue 6: 100 - 108

DOI: https://doi.org/10.11978/2017043

海洋生物学

Identification and phylogenetic analysis of Sagittidae (Chaetognatha) in the South China Sea based on mitochondrial CO#cod#x02160; gene

  • CHEN Bin ,
  • HE Wei ,
  • LI Haitao ,
  • WU Peng ,
  • Xiao Yuzhang ,
  • LYU Xiangli ,
  • HE Jing
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  • South China Sea Environmental Monitoring Center, State Oceanic Administration, People#cod#x02019;s Republic of China, Guangzhou 510300, China
Corresponding author: LYU Xiangli. E-mail:

Received date: 2017-04-11

  Request revised date: 2017-06-08

  Online published: 2018-01-18

Supported by

Guangdong Natural Science Foundation (2014A030310495)

Director Fund of Marine Science and Technology, South China Sea Branch, State Oceanic Administration, People#cod#x02019;s Republic of China (1513)

Copyright

热带海洋学报编辑部
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Abstract

To improve the accuracy of Chaetognatha identification, we combined morphological identification and DNA barcoding based on the mitochondrial CO#cod#x02160;(cytochrome oxidase subunit #cod#x02160;) gene to identify some arrow worms from the northern South China Sea. The results showed that the morphologically and molecularly identified results were consistent, for the species of Ferosagitta robusta, Aidanosagitta neglecta and Aidanosagitta regularis. Furthermore, the neighbor-joining phylogenetic tree was constructed with the amplified CO#cod#x02160; sequences and those homologous sequences from GenBank based on Kimura 2-parameter, and the phylogenetic positions of Sagiitta (Sagittidae, Sagittoidea) were discussed. The results indicated that these CO#cod#x02160; sequences formed monophylotic clades compared with GenBank (91%~100%). The intraspecific genetic distance ranged from 0.000 to 0.015 with an average value of 0.004, while the interspecific genetic distance ranged from 0.081 to 0.173 with an average value of 0.127. The barcoding gap was detected between intra and interspecific variations, suggesting that the CO#cod#x02160; gene could be a standard DNA barcode for the Chaetognatha identification. This study was the first to apply DNA barcoding to phylogenetic analysis of Sagittidae, and to discuss the phylogenetic position at molecular level.

Key words： DNA barcoding; CO#cod#x02160;; gene; phylogeny; Chaetognatha; Sagittidae

Cite this article

CHEN Bin , HE Wei , LI Haitao , WU Peng , Xiao Yuzhang , LYU Xiangli , HE Jing . Identification and phylogenetic analysis of Sagittidae (Chaetognatha) in the South China Sea based on mitochondrial CO#cod#x02160; gene[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2017 , 36(6) : 100 -108 . DOI: 10.11978/2017043

毛颚动物门(Chaetognatha)是海洋浮游动物的重要类群之一, 是海洋食物链的一个重要环节, 是能量流动的传递者。该类浮游动物虽种类不多, 但在海洋中数量多并且分布广, 其分布与海洋水文环境关系密切。毛颚动物是厄尔尼诺现象的指示生物(Nagasawa 1984); 同时, 也是海流、水团良好的指示生物, 每一水团、海流都有其特有的毛颚动物, 对其进行追踪, 可探索水团消长、海流的来龙去脉等(萧贻昌, 2004)。毛颚动物作为指示生物的研究也已向污染指示生物推进(Daponte et al, 2004)。因此, 开展毛颚动物多样性研究是海洋生态系统保护的需求, 对海洋开发与保护具有重要意义。
毛颚动物门目前仅有箭虫纲(Sagittoidea)一大纲, 其分类地位的混乱现象由来已久, 以箭虫科(Sagittidae)为甚, 除齿箭虫属(Serratosagitta)外, 对其他各属的分类地位看法不一。毛颚动物的物种鉴定也一直是分类学工作的难点, 主要原因有: 1)现存的毛颚动物各个种类都有为数不多并具甄别性特点的组织结构, 而这些结构具有同质性(homogeneity)(Papillon et al, 2006), 特别是尚未发育成熟、结构形态特征不明显的毛颚动物幼体, 需经验丰富的专业分类鉴定专家才可准确区分鉴定; 2)毛颚动物存在分层栖息现象, 不同层次的同种毛颚动物其外部形态也有差异; 3)同种毛颚动物甚至同一个体在不同发育期间的形态结构也不尽相同, 以纤毛冠和储精囊的形态变化最为明显; 4)越来越多的研究结果表明, 毛颚动物(尤其是世界广布种)存在隐存种(cryptic species)(Peijnenburg et al, 2005), 因此真正的物种多样性水平无法从形态多样性体现。南海有34种毛颚动物曾被记录, 几乎涵盖我国所有种类(杜飞雁 等, 2003), 鉴定工作难度较大, 亟须分子分类学手段予以辅助。
DNA条形码标准基因可以在种内、种间遗传距离水平上有效区分物种(K#cod#x000f6;hler, 2007)。线粒体编码的细胞色素氧化酶第一亚基(cytochrome oxidase subunit #cod#x02160;, 后文简称CO#cod#x02160;)是适合多数海洋生物进行物种鉴定的条形码基因(Fr#cod#x000e9;zal et al, 2008; Bucklin et al, 2010; Jennings et al, 2010; Radulovici et al, 2010)。目前国内外鲜见基于CO#cod#x02160;基因对毛颚动物进行分子鉴定及系统发育分析的相关报道。
本文以采集的毛颚动物箭虫科样品为材料, 采用形态学方法结合基于CO#cod#x02160;基因序列的分子鉴定方式进行种类鉴定并初步探讨其系统发育地位。该方法一方面是为了更深入探究毛颚动物, 提高毛颚动物种类鉴定的效率及准确性; 另一方面也可探索DNA条形码技术在海洋生物多样性业务化监测中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本文所用材料为国家海洋局南海环境监测中心于2016年在南海北部海域采样所得, 采样位置在19#cod#x000b0;06#cod#x02032;38″#cod#x02014;21#cod#x000b0;35#cod#x02032;28″N, 110#cod#x000b0;46#cod#x02032;03″#cod#x02014;114#cod#x000b0;03#cod#x02032;47″E之间, 用大型浮游生物网(网口内径80cm, 网口面积0.5m2)自水深200m至表层垂直拖取浮游动物样品。样品采集后保存于95%乙醇中。

1.2 实验方法

1.2.1 形态学鉴定
挑选性腺发育成熟, 形态特征完整的箭虫个体, 参照《中国动物志: 无脊椎动物》第38卷毛颚动物箭虫科各种属外部形态特征及图谱进行分类鉴定(萧贻昌, 2004)。借助Zeiss Stemi2000c显微镜观察箭虫个体体长、肌肉透明度、颚齿、颚毛数、颈部特征、泡状组织、腹神经节及其与前鳍的相对位置、前侧尾三部分鳍条形状及间距、储精囊和卵巢等特征并与图谱进行比对, 并采集图像。
1.2.2 DNA提取和PCR扩增
将形态学鉴定后同种的箭虫各取3个进行分子实验, 3个未定种全部进行分子实验。样品DNA采用改良CTAB法抽提(Williams et al, 2003), 采用引物LCO-1490(5#cod#x02019;- GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3#cod#x02019;)和LCO-2198 (5#cod#x02019;-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3#cod#x02019;) (Folme, 1994)扩增线粒体CO#cod#x02160;基因片段。
PCR反应体系总体积为50#cod#x000b5;L, 其中: 2#cod#x000D7;buffer 25#cod#x000b5;L, dNTP 10#cod#x000b5;L, 引物各1.5#cod#x000b5;L, Taq DNA聚合酶(TOYOBO公司) 0.75#cod#x000b5;L, DNA模板 1#cod#x000b5;L, 加去离子水补足至50#cod#x000b5;L。PCR反应条件为: 94℃预变性2min; 98℃变性15s, 50℃退火30s, 68℃延伸1min, 共35个循环; 最后68℃延伸10min, 产物16℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收纯化, 然后进行双向测序, 测序引物同PCR扩增引物。
1.2.3 数据分析
所获原始序列首先用chromas以ab1形式打开与其对应峰图比对检查, 以确认序列质量; 利用SeqMan 7.1.0软件对序列进行拼接, 人工校正剪去两端不可靠的碱基序列, 并在NCBI上与GenBank下载的其他毛颚动物箭虫科CO#cod#x02160;序列进行BLAST比对分析, 测序获得的序列与相似物种的序列用MEGA6软件内置的clustalw程序进行多重序列比对, 计算碱基组成和基于Kimura双参数模型(Kimura 2-parameter, K2P)的遗传距离, 利用该软件中的邻接法(neighbor-joining, NJ)和最大相似法构建系统进化树, 可靠性经过1000次自展(Bootstrap)检验, 最佳进化模型为Transitions + Transversions, 同时利用最大相似法(maximum- likelihood, GTR+G+I模型)构建系统发育树。

2 结果

2.1 形态学鉴定结果

采样获得的样品经挑选得发育成熟、形态完整的箭虫个体43个, 其中40个个体参照《南海北部和中部的毛颚类》(中国科学院南海海洋研究所, 1983)和《中国动物志: 无脊椎动物》第38卷毛颚动物门(萧贻昌, 2004)对箭虫科各种的形态学描述得到初步鉴定结果, 包括粗壮猛箭虫(Ferosagitta robusta)、肥胖软箭虫(Flaccisagitta enflata)、凶型猛箭虫(Ferosagitta ferox)、小型滨箭虫(Aidanosagitta neglecta)和规则滨箭虫(Aidanosagitta regularis), 另外有3个个体因其形态学特征不明显, 无法通过形态学分析准确鉴定, 暂命名为未定种(后文统一简称Sagitta spp.)。主要形态学特征描述见表1, 箭虫种类比例如图1所示, 部分箭虫个体外部形态采集图像见图2。
Tab. 1 Morphological characters of Sagittidae

表1 箭虫的主要形态学特征

种名 数量 主要形态特征
粗壮猛箭虫
Ferosagitta robusta		 15 体长10~12mm, 体坚硬, 不透明, 身体从头到尾隔的宽度相等。颈部明显, 领发达, 肠分歧, 卵巢宽大, 卵呈梨形, 储精囊呈倒梨型, 前鳍椭圆形, 后鳍呈圆形, 尾鳍呈三角形
肥胖软箭虫
Flaccisagitta enflata		 5 体长8~20mm, 体肥胖、柔软、透明, 颈部短, 无领, 肠不分歧, 卵巢短, 卵呈圆形, 储精囊呈球形, 前鳍仅边缘具鳍条, 尾鳍呈半圆形
凶型猛箭虫
Ferosagitta ferox		 8 体长9~16mm, 体坚实、不透明, 头大, 颈部明显, 肠分歧, 卵巢呈管状, 向前伸展可达颈部, 储精囊呈长卵圆形, 后鳍中央具一条狭小无鳍条带
规则滨箭虫
Aidanosagitta regularis		 6 体长6mm, 体细长, 较坚硬, 颈部不明显, 头到前鳍前半部的领非常发达, 其余为薄层延伸到尾, 卵巢前伸达腹神经节, 储精囊呈耳形
小型滨箭虫
Aidanosagitta neglecta		 6 体长6~9mm, 体坚硬、不透明, 颈部不明显, 领从颈到前鳍前端厚, 肠分歧, 卵巢充满体腔, 储精囊呈卵圆形, 接近后鳍但与尾鳍分离, 前后鳍均充满鳍条
未定种
Sagitta spp.		 3 体长15~16mm, 体坚实、不透明, 头大, 颈部明显。卵巢达前鳍中部, 卵大而圆, 储精囊呈耳状, 前鳍较后鳍长且大, 后鳍稍圆, 其中央无鳍条
Fig. 1 The proportion of Sagittidae

图 1 箭虫科种类比例

Fig. 2 Features of Sagittidae.

(a) Ferosagitta robusta, (b) Aidanosagitta neglecta, (c) Aidanosagitta regularis, (d) Ferosagitta ferox, (e) head of Ferosagitta ferox, (f) collarette of Aidanosagitta regularis, (g) seminal visical of Ferosagitta robusta, and (h) tale of Aidanosagitta regularis

图 2 部分箭虫外部形态

a. 粗壮猛箭虫; b. 小型滨箭虫; c. 规则滨箭虫; d. 凶型猛箭虫; e. 凶型猛箭虫头部; f. 规则滨箭虫泡状组织; g. 粗壮猛箭虫储精囊; h. 规则滨箭虫尾部

2.2 测序结果

肥胖软箭虫为南海海域常见优势种, 但因其个体相对较柔软且肌肉薄, 利用乙醇作为固定剂对提取的DNA浓度及质量可能有较大影响, 进而导致测序结果不理想。最终共获得12条毛颚动物箭虫科CO#cod#x02160;基因序列, 序列上传至GenBank, 序列号为KY882123-KY882134, 相关信息见表2, 测序获得的CO#cod#x02160;基因序列经人工去除引物区及两端不可靠碱基序列后长度均为655bp。

2.3 碱基组成

分析各序列碱基组成, 均无插入和缺失位点, 核苷酸 A、C、G、T的平均含量分别为 22.0%、23.0%、22.2%和 32.8%, A+T含量(54.8%)明显高于 G+C 含量(45.2%), 这与一般线粒体基因组碱基组成的特点相符合。不同密码子表现出各自的特征, 第一位密码子和第三位密码子均表现出不同程度的 T 偏好, 第二位密码子则表现出一定强度的G偏好。
Tab. 2 Specimen information for which DNA barcodes were analyzed in this study, including phylogenetic position, species name and GenBank Accession Number

表2 本研究涉及序列的名称、系统分类地位(科、属)及序列对应的GenBank登录号

序号 分类地位 中文种名 拉丁种名 GenBank登录号 来源
1 箭虫科猛箭虫属 粗壮猛箭虫 Ferosagitta robusta KY882128 南海北部
2 箭虫科猛箭虫属 粗壮猛箭虫 Ferosagitta robusta KY882126 南海北部
3 箭虫科猛箭虫属 粗壮猛箭虫 Ferosagitta robusta KY882127 南海北部
4 箭虫科猛箭虫属 凶型猛箭虫 Ferosagitta ferox KY882123 南海北部
5 箭虫科猛箭虫属 凶型猛箭虫 Ferosagitta ferox KY882124 南海北部
6 箭虫科猛箭虫属 凶型猛箭虫 Ferosagitta ferox KY882125 南海北部
7 箭虫科猛箭虫属 规则滨箭虫 Aidanosagitta regularis KY882129 南海北部
8 未定 未定种 Sagitta spp. KY882132 南海北部
9 未定 未定种 Sagitta spp. KY882133 南海北部
10 未定 未定种 Sagitta spp. KY882134 南海北部
11 箭虫科滨箭虫属 小型滨箭虫 Aidanosagitta neglecta KY882130 南海北部
12 箭虫科滨箭虫属 小型滨箭虫 Aidanosagitta neglecta KY882131 南海北部
13 箭虫科猛箭虫属 粗壮猛箭虫 Ferosagitta robusta JN258035.1 GenBank
14 箭虫科滨箭虫属 正形滨箭虫 Aidanosagitta regularis FJ538304.1 GenBank
15 箭虫科软箭虫属 肥胖软箭虫 Flaccisagitta enflata KF977332 GenBank
16 箭虫科滨箭虫属 强壮滨箭虫 Aidanosagitta crassa HQ700947.1 GenBank
17 箭虫科带箭虫属 纳嘎带箭虫 Zonosagitta nagae NC013810.1 GenBank
18 箭虫科带箭虫属 百陶带箭虫 Zonosagitta bedoti JN258005.1 GenBank
19 箭虫科滨箭虫属 小型滨箭虫 Aidanosagitta neglecta JN258022 GenBank
20 箭虫科箭虫属 双斑箭虫 Sagitta bipunctata GQ368396 GenBank

2.4 遗传距离

结合从GenBank获得的8条毛颚动物箭虫科不同种属CO#cod#x02160;序列(序列号及相关信息见表2), 对20条箭虫科CO#cod#x02160;基因的遗传距离进行分析, 遗传距离见表3。箭虫科各种内遗传距离在0.000~0.015之间, 平均值为0.004, 大部分种类其种内遗传距离较小, 如本研究中的2条粗壮猛箭虫CO#cod#x02160;序列与GenBank记录的采自印度洋海域的粗壮猛箭虫(Ferosagitta robusta) CO#cod#x02160;序列(0.000~0.006)、本研究中的2条小型滨箭虫CO#cod#x02160;序列与GenBank获得的小型滨箭虫(Aidanosagitta neglecta) CO#cod#x02160;序列(0.000~0.006), 凶型猛箭虫CO#cod#x02160;序列(0.000)、规则滨箭虫CO#cod#x02160;序列(0.004)、本研究中的 Sagitta spp. CO#cod#x02160;序列(0.000~ 0.015)。箭虫科CO#cod#x02160;基因序列的种间遗传距离较高, 在0.081~0.173之间, 平均值为0.127, 其中, 部分属内种间遗传距离相对较低, 如粗壮猛箭虫与凶型猛箭虫为0.083、纳嘎带箭虫(Zonosagitta nagae)与百陶带箭虫(Zonosagitta bedoti) 为0.121, 属间遗传距离则相对较高, 如肥胖软箭虫(Flaccisagitta enflata)与凶型猛箭虫为0.173, 与百陶带箭虫为0.168等。Sagitta spp. CO#cod#x02160;序列与猛箭虫属(Ferosagitta)各种间遗传距离较小, 在0.092~ 0.105之间, 平均值为0.097, 与猛箭虫属外其他种间距离相对较高, 平均值为0.126。
结果表明, 毛颚动物箭虫科CO#cod#x02160;基因序列其种间遗传距离高于种内遗传距离30倍, 差异显著(P#cod#x0003C;0.05)。种内及种间遗传距离无重叠范围, 存在明显的条形码间隙。

2.5 系统发育树

系统发育邻接树( neighbor-joining tree, K2P模型)拓扑结构及相关支持率见如图3。经形态学鉴定后得到的形态种(morphospecies)粗壮猛箭虫、规则滨箭虫和小型滨箭虫, 其CO#cod#x02160;序列与GenBank得到的相应箭虫CO#cod#x02160;序列均形成各自的单系枝并得到了较高的支持率(91%~100%)。GenBank及BOLD数据库(Barcode of Life Data System)均未有凶型猛箭虫CO#cod#x02160;序列的记录, 无法进行BLAST比对, 经形态学鉴定后得到的凶型猛箭虫其CO#cod#x02160;序列以100%高支持率聚成一个单系枝。3个Sagitta spp.个体经形态学分析无法鉴定到种, 经过BLAST比对也未找到与之匹配的毛颚动物序列, 但这三条序列以100% 高支持率形成一个单系枝。凶型猛箭虫、粗壮猛箭虫及Sagitta spp.在系统发育树中显示为单系群体, 百陶带箭虫与纳嘎带箭虫形成一个单系群体, 部分属的分类阶元在系统发育树中得到体现。
Tab. 3 Distance estimation based on CO#cod#x02160; gene sequences using Kimura 2-parameter model

表 3 基于CO#cod#x02160;基因序列通过K2P模型计算的箭虫科遗传距离

序号 种名 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1 Ferosagitta robusta
2 Ferosagitta robusta 0.006
3 Ferosagitta robusta 0.002 0.004
4 Ferosagitta robusta 0.002 0.004 0.000
5 Ferosagitta ferox 0.083 0.086 0.081 0.081
6 Ferosagitta ferox 0.083 0.086 0.081 0.081 0.000
7 Ferosagitta ferox 0.083 0.086 0.081 0.081 0.000 0.000
8 Aidanosagitta regularis 0.141 0.143 0.143 0.143 0.160 0.160 0.160
9 Aidanosagitta regularis 0.141 0.143 0.143 0.143 0.160 0.160 0.160 0.004
10 Aidanosagitta neglecta 0.131 0.129 0.129 0.129 0.121 0.121 0.121 0.138 0.143
11 Aidanosagitta neglecta 0.131 0.129 0.129 0.129 0.121 0.121 0.121 0.138 0.143 0.000
12 Aidanosagitta neglecta 0.129 0.126 0.126 0.126 0.124 0.124 0.124 0.141 0.145 0.006 0.006
13 Aidanosagitta crassa 0.131 0.129 0.133 0.133 0.099 0.099 0.099 0.138 0.143 0.124 0.124 0.126
14 Sagitta spp. 0.092 0.090 0.094 0.094 0.105 0.105 0.105 0.141 0.141 0.136 0.136 0.138 0.103
15 Sagitta spp. 0.096 0.094 0.099 0.099 0.096 0.096 0.096 0.141 0.141 0.126 0.126 0.129 0.103 0.015
16 Sagitta spp. 0.092 0.090 0.094 0.094 0.105 0.105 0.105 0.141 0.141 0.136 0.136 0.138 0.103 0.000 0.015
17 Zonosagitta nagae 0.136 0.143 0.138 0.138 0.112 0.112 0.112 0.124 0.129 0.119 0.119 0.126 0.092 0.121 0.121 0.121
18 Zonosagitta bedoti 0.143 0.150 0.145 0.145 0.115 0.115 0.115 0.155 0.155 0.126 0.126 0.129 0.112 0.143 0.138 0.143 0.121
19 Sagitta bipunctata 0.129 0.126 0.126 0.126 0.143 0.143 0.143 0.121 0.126 0.141 0.141 0.138 0.126 0.148 0.143 0.148 0.145 0.143
20 Flaccisagitta enflata 0.143 0.150 0.145 0.145 0.173 0.173 0.173 0.170 0.170 0.150 0.150 0.153 0.160 0.148 0.153 0.148 0.160 0.168 0.153
Fig. 3 Phylogenetic tree based on CO#cod#x02160; gene sequences using Neighbor-joining method. No. 1~12 represent sequences obtained in this study, and No. 13~20 represent sequences obtained from GenBank

图 3 基于CO#cod#x02160;基因序列通过邻接法构建的系统发育树(序号1~12为本研究测得的序列, 序号13~20为从Genbank获得的序列)

3 讨论

3.1 鉴定结果分析

基于DNA条形码技术, 粗壮猛箭虫、小型滨箭虫和规则滨箭虫在内的毛颚动物其形态鉴定结果与分子鉴定的结果一致。经形态学鉴定后初步定种为凶型猛箭虫者, 虽GenBank及BOLD数据库均未有凶型猛箭虫CO#cod#x02160;序列的记录而未能以分子鉴定加以辅证, 但据其形态学特征, 及其与同属的粗壮猛箭虫亲缘关系最近, 仍可给予确认为凶型猛箭虫。
本研究中的Sagitta spp., 通过形态学分析难以鉴定到种, 经过分子生物学实验并测序后, 虽然三条CO#cod#x02160;序列种内遗传差异稍大于其他种的种内遗传距离(0.000~0.015), 但经BLAST比对后具有高度相似性, 在构建的系统发育树中形成一个单系枝。鉴于数据库中并无与之相似序列, 参考历史数据及相关形态学资料(中国科学院南海海洋研究所, 1983), 未发现有与该种一致的形态学记录, 可能为南海新记录种。且Sagitta spp. CO#cod#x02160;序列与猛箭虫属各种间遗传距离较小, 与箭虫科其他属外遗传距离则相对较大, 其体坚实、肌肉厚且不透明等外部形态特征与猛箭虫属基本特征吻合, 不排除其隶属于猛箭虫属。值得注意的是, 从遗传距离来看, 这三个个体虽为同一种, 但其中有部分种内遗传距离偏高, 可能已发生种内基因突变, 存在亚种。有关该种的研究结果需进一步探究。

3.2 毛颚动物箭虫科系统分类地位

我国海域发现的毛颚动物主要是箭虫纲无横肌目(Aphragmophora), 包括翼箭虫科(Pterosagitta, 仅有翼箭虫属1属)、箭虫科(Sagittidae)和撬虫科(Krohnittidae, 仅有撬虫属1属)。其中, 箭虫科为最大一科, 但其分类系统最为混乱, 分类地位不统一: 1)国内大部分毛颚动物分类系统相关文献、《中国海洋生物种类与分布》(黄宗国, 2008)毛颚动物门一节及《中国动物志: 无脊椎动物》第38卷毛颚动物门(萧贻昌, 2004)中认为箭虫科的毛颚动物各种全部隶属于箭虫属(Sagitta)一属, 即认为箭虫科仅包括箭虫属(广义); 2)在《中国海洋生物名录》(刘瑞玉, 2008)毛颚动物门箭虫科一节中, 则将南海常见的箭虫科各种分为12属31种; 3)在国外最早的毛颚动物分类纲要中, 毛颚动物被分为5科16属, 后来在此基础上增加了6属(Tokioka, 1965a, b; Bieri, 1991), 其中认为箭虫科应分为箭虫属(狭义)、滨箭虫属(Aidanosagitta)、猛箭虫属(Ferosagitta)、软箭虫属(Flaccisagitta)、中箭虫属(Mesosagitta)、齿箭虫属(Serratosagitta)、带箭虫属(Zonosagitta)、秃鳍箭虫属(Abaciasagitta)等12个属, 据此分类系统, 狭义的箭虫属仅有双斑箭虫(Sagitta bipunctata)1种, 其他我国常见的毛颚动物箭虫科各种隶属于不同属。因箭虫科分类系统矛盾较大, 在生物多样性监测及相关研究中经常出现同种但拉丁名不一致的情况。
本研究为国内外首次利用DNA条形码技术(CO#cod#x02160;基因)对毛颚动物箭虫纲箭虫科各属进行系统发育分析, 首次从分子层面探讨箭虫科内各属的系统发育地位。根据本研究系统发育分析的结果, 部分种间遗传距离较高, 而同属各种间的遗传距离及亲缘关系相对较近。同时, 在本研究构建的系统发育树中, 毛颚动物箭虫科部分属的分类阶元也得到体现, 如粗壮猛箭虫和凶型猛箭虫显示为一个单系群体, 百陶带箭虫和纳嘎带箭虫的单系性在系统发育树中也可体现, 支持将箭虫科划分为不同属而非仅仅箭虫属一个属。分析箭虫科各种的进化顺序, 粗壮猛箭虫和凶型箭虫隶属的猛箭虫属位于拓扑结构的末端位置, 我们推断其为最近分化的一属, 位于系统发育树根部的肥胖软箭虫隶属的软箭虫属则是较早分化出的一属。

3.3 CO#cod#x02160;基因在毛颚动物鉴定中的应用

一般情况下, 有效的DNA条形码应存在条形码间隔, 即种内、种间有明显的遗传距离差异, 种间遗传差异应达到种内遗传差异的10倍(Hebert et al, 2003)。本研究所涉及的毛颚动物箭虫科CO#cod#x02160;序列存在明显的条形码间隔, 种间遗传距离高于种内遗传距离30倍, 证实了CO#cod#x02160;基因作为毛颚动物DNA条形码标准基因的可行性。然而, 目前绝大部分毛颚动物的CO#cod#x02160;基因序列还未被GenBank和BOLD等数据库收录, 本研究为Genbank新增了凶型箭虫的CO#cod#x02160;基因序列3条, 增补了粗壮猛箭虫、小型滨箭虫和规则滨箭虫的序列, 但如圆囊滨箭虫(Aidanosagitta johorensis)、太平洋齿箭虫(Serratosagitta pacifica)和布氏带箭虫(Zonosagitta bruuni)等均未有其CO#cod#x02160;基因相关序列信息, 毛颚动物遗传学数据库不够完备, 所以单纯依靠DNA条形码目前还难以将所有毛颚动物种类鉴定到种。此外, 各类遗传数据库中的DNA序列未必都能被准确鉴定, 可能包含某些误判的种(Shen et al, 2013), 不能保证基于DNA条形码的物种鉴定的准确性。对于一些数据库中缺乏高度相似性物种信息的序列, 如本研究中的凶型猛箭虫, 一般可通过系统发育分析来确定其分类地位。但是, 单个基因数据有时并不能准确反映真实的系统发育关系(Puillandre et al, 2009), 未来将继续深入探究16S等其他DNA条形码基因序列在毛颚动物分子鉴定及系统发育中的应用。

3.4 展望

在海洋生物多样性监测工作中, 传统的形态学鉴定仍然是主要的分类鉴定手段, 但由于海洋生物简单的外部形态和内部生理结构的趋同性以及高度的表型可变性, 加上国内专业分类学家日渐稀缺, 单纯运用传统分类法已难以准确区分和鉴定, 这使得DNA条形码在海洋生物的开发和应用受到关注, 将DNA条形码技术应用到业务化监测中十分迫切。形态鉴定和DNA条形码技术相结合, 会极大地提升生物多样性的监测水平, 提高监测数据的准确性。展望未来, 将会有越来越多的海洋生物DNA条形码数据产生, 完善我国乃至全球海洋生物DNA条形码数据库, 为海洋生物多样性研究及保护提供强有力的数字化补充。

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